【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单细胞分泌组分析
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35 U.S.C.
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119(e)要求2020年12月15日提交的美国临时专利申请系列第63/125629号的权益，该相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
[0003]背景
[0004]领域
[0005]本公开内容总体上涉及分子生物学领域，例如使用分子条形码化确定细胞的分泌分子谱。
[0006]对相关技术的描述
[0007]当前的技术通过在单细胞中的每一个与条形码化试剂珠在隔室(compartment)中共定位时将细胞特异性寡核苷酸条形码附接至来自个体细胞的多(A)mRNA分子而允许以大规模并行的方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达。基因表达可能影响蛋白表达和分子的分泌。蛋白
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蛋白相互作用可能影响细胞的基因表达和蛋白表达以及分子的分泌。细胞释放的细胞因子和其他分子是免疫学家和其他细胞生物学家非常感兴趣的。用于检测和测量分泌蛋白的传统方法通常是批量测量(而不是在单细胞水平)。例如，当前可用的方法包括用于批量研究分泌因子的基于珠的测定和ELISA。因此，数据中缺少单细胞定量和细胞表型分析。在流式细胞术与传统蛋白印迹的比较中，研究来自细胞异质性混合物的个体细胞有巨大的价值。越来越需要将特定的分泌活性与复杂的细胞表型关联。由于可用于显微镜或流式细胞术分析的荧光标志物的数目，目前可用的用于检测分泌蛋白的方法对可检测的蛋白的数目有限制。此外，由于测量荧光强度差异的限制，这...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于测量由单细胞分泌的分泌因子的拷贝数的方法，所述方法包括：使一个或更多个单细胞与第一多于一个第一固体支持物接触，其中所述一个或更多个单细胞能够分泌多于一种分泌因子，其中每一个第一固体支持物包含能够与由单细胞分泌的所述多于一种分泌因子中的至少一种特异性结合的多于一种捕获探针；使所述第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触，每一种分泌因子结合试剂能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合，其中所述多于一种分泌因子结合试剂中的每一种包含分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸，所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含用于所述分泌因子结合试剂的独特因子标识符序列；使多于一种寡核苷酸条形码与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸接触以进行杂交，其中所述寡核苷酸条形码各自包含第一分子标记；使与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一个条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸，所述多于一个条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸各自包含与所述独特因子标识符序列的至少一部分互补的序列和所述第一分子标记；以及获得所述多于一个条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息，以确定由所述一个或更多个单细胞中的每一个分泌的所述至少一种分泌因子的拷贝数。2.根据权利要求1所述的方法，其中使一个或更多个单细胞与第一多于一个第一固体支持物接触包括将所述一个或更多个单细胞和所述第一多于一个第一固体支持物分区到多于一个第一分区，其中所述多于一个第一分区中的第一分区包含所述一个或更多个单细胞中的单细胞和所述第一多于一个第一固体支持物中的单个第一固体支持物。3.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括在使所述第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触之前：汇集来自所述多于一个第一分区中的每一个第一分区的所述单个第一固体支持物以产生第二多于一个第一固体支持物。4.根据权利要求3所述的方法，其中使所述第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触包括使所述第二多于一个第一固体支持物与所述多于一种分泌因子结合试剂接触。5.根据权利要求4所述的方法，所述方法包括在使所述第二多于一个第一固体支持物与所述多于一种分泌因子结合试剂接触之后，去除所述多于一种分泌因子结合试剂中未与所述第二多于一个第一固体支持物接触的一种或更多种分泌因子结合试剂以产生第三多于一个第一固体支持物。6.根据权利要求5所述的方法，其中去除未与所述第二多于一个第一固体支持物接触的所述一种或更多种分泌因子结合试剂包括：去除未与所述分泌因子中被捕获探针结合的相应至少一种分泌因子接触的所述一种或更多种分泌因子结合试剂。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中使多于一种寡核苷酸条形码与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸接触以进行杂交包括：将所述第三多于一个第一固体支持物分区到多于一个第二分区，其中所述多于一个第二分区中的第二分区包含来自所述第三多于一个第一固体支持物的单个第一固体支持物；以及
在包含所述单个第一固体支持物的所述第二分区中，使多于一种寡核苷酸条形码与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸接触以进行杂交。8.一种用于测量由单细胞分泌的分泌因子的拷贝数和单细胞中核酸靶的拷贝数的方法，所述方法包括：使一个或更多个单细胞与第一多于一个第二固体支持物接触以形成与第二固体支持物关联的一个或更多个单细胞，其中所述一个或更多个单细胞包含表面细胞靶和核酸靶的拷贝，其中所述一个或更多个单细胞能够分泌多于一种分泌因子，其中每一个第二固体支持物包含多于一种捕获探针和多于一种锚定探针，其中所述多于一种锚定探针中的每一种能够与所述表面细胞靶特异性结合，并且其中所述捕获探针能够与由单细胞分泌的所述多于一种分泌因子中的至少一种特异性结合；使与第二固体支持物关联的一个或更多个单细胞与多于一种分泌因子结合试剂接触，所述多于一种分泌因子结合试剂能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合，其中所述多于一种分泌因子结合试剂中的每一种包含分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸，所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含用于所述分泌因子结合试剂的独特因子标识符序列；使多于一种寡核苷酸条形码与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸和所述核酸靶的拷贝接触以进行杂交，其中所述寡核苷酸条形码各自包含第一分子标记；使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一个条形码化核酸分子，所述多于一个条形码化核酸分子各自包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列和所述第一分子标记；使与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一个条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸，所述多于一个条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸各自包含与所述独特因子标识符序列的至少一部分互补的序列和所述第一分子标记；获得所述多于一个条形码化核酸分子或其产物的序列信息，以确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述核酸靶的拷贝数；以及获得所述多于一个条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息，以确定由所述一个或更多个单细胞中的每一个分泌的所述至少一种分泌因子的拷贝数。9.根据权利要求8所述的方法，其中使一个或更多个单细胞与所述第一多于一个第二固体支持物接触以形成与第二固体支持物关联的一个或更多个单细胞包括：将所述一个或更多个单细胞和所述多于一个第二固体支持物分区到多于一个第一分区，其中所述多于一个第一分区中的第一分区包含所述一个或更多个单细胞中的单细胞和所述多于一个第二固体支持物中的单个第二固体支持物，其中所述单细胞能够通过与所述表面细胞靶结合的锚定探针与第二固体支持物进行关联。10.根据权利要求9所述的方法，所述方法包括在使与第二固体支持物关联的所述一个或更多个单细胞与多于一种分泌因子结合试剂接触之前：汇集来自所述多于一个第一分区中的每一个第一分区的与第二固体支持物关联的单细胞，以产生与第二固体支持物关联的第一多于一个单细胞。11.根据权利要求10所述的方法，其中使与第二固体支持物关联的所述一个或更多个单细胞与多于一种分泌因子结合试剂接触包括使与第二固体支持物关联的所述第一多于
一个单细胞与所述多于一种分泌因子结合试剂接触。12.根据权利要求11所述的方法，所述方法包括在使与第二固体支持物关联的所述第一多于一个单细胞与所述多于一种分泌因子结合试剂接触之后，去除所述多于一种分泌因子结合试剂中未和与第二固体支持物关联的所述第一多于一个单细胞接触的一种或更多种分泌因子结合试剂以产生与第二固体支持物关联的第二多于一个单细胞，任选地去除未和与第二固体支持物关联的所述第一多于一个单细胞接触的所述一种或更多种分泌因子结合试剂包括：去除未与所述分泌因子中被捕获探针结合的相应至少一种分泌因子接触的所述一种或更多种分泌因子结合试剂。13.根据权利要求8
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12中任一项所述的方法，所述方法包括在使多于一种寡核苷酸条形码与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸和所述核酸靶的拷贝接触以进行杂交之前：将与第二固体支持物关联的所述第二多于一个单细胞分区到多于一个第二分区，其中所述多于一个第二分区中的第二分区包含来自与第二固体支持物关联的所述第二多于一个单细胞的单细胞和单个第二固体支持物；在包含所述单细胞和所述单个第二固体支持物的所述第二分区中，使多于一种寡核苷酸条形码与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸和所述核酸靶的拷贝接触以进行杂交。14.根据权利要求13所述的方法，所述方法包括裂解所述第二分区中的所述单细胞，并且任选地裂解所述单细胞包括加热所述样品、使所述样品与去污剂接触、改变所述样品的pH或其任何组合。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个单细胞包括T细胞、B细胞、肿瘤细胞、髓样细胞、血细胞、正常细胞、胎儿细胞、母体细胞或其混合物。16.根据权利要求1
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15中任一项所述的方法，其中所述至少一种分泌因子包括：(i)淋巴因子、白细胞介素、趋化因子或其任何组合；(ii)细胞因子、激素、分子毒素或其任何组合；和/或(iii)神经生长因子、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板源生长因子、转化生长因子、骨诱导因子、干扰素、集落刺激因子或其任何组合，任选地所述至少一种分泌因子包括血管生成素、血管生成蛋白
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1、血管生成蛋白
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2、bNGF、组织蛋白酶S、半乳凝素
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7、GCP
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2、G
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CSF、GM
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CSF、PAI
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1、PDGF
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AA、PDGF
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BB、PDGF
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AB、PlGF、PlGF
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2、SDF
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1、Tie2、VEGF
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A、VEGF
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C、VEGF
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D、VEGF
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R1、VEGF
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R2、VEGF
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R3、6Ckine、血管生成蛋白
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1、血管生成蛋白
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2、BLC、BRAK、CD186、ENA
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78、嗜酸性粒细胞趋化因子
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1、嗜酸性粒细胞趋化因子
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2、嗜酸性粒细胞趋化因子
‑
3、EpCAM、GDF
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15、GM
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CSF、GRO、HCC
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4、I
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309、IFN
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γ、IL
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1α、IL
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1β、IL
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1R4(ST2)、IL
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2、IL
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2R、IL
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3、IL
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3Rα、IL
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5、IL
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6、IL
‑
6R、IL
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7、IL
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8、IL
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8RB、IL
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11、IL
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12、IL
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12p40、IL
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12p70、IL
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13、IL
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13R1、IL
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13R2、IL
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15、IL
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15Rα、IL
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16、IL
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17、IL
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17C、IL
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17E、IL
‑
17F、IL
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17R、IL
‑
18、IL
‑
18BPa、IL
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18Rα、IL
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20、IL
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23、IL
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27、IL
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28、IL
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31、IL
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33、IP
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10、I
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TAC、LIF、LIX、LRP6、MadCAM
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1、MCP
‑
1、MCP
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2、MCP
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3、MCP
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4、M
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CSF、MIF、MIG、MIP
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1γ、MIP
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1α、MIP
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1β、MIP
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1δ、MIP
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3α、MIP
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3β、MPIF
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1、PARC、PF4、RANTES、抵抗素、SCF、SCYB16、TACI、TARC、TSLP、TNF
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α、TNF
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R1、TRAIL
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R4、TREM
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1、激活蛋白A、双调蛋白、Axl、BDNF、BMP4、组织蛋白酶S、EGF、FGF
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1、FGF
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2、FGF
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7、FGF
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21、卵泡抑制素、半乳凝素
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7、Gas6、GDF
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15、HB
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EGF、HGF、IGFBP
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1、IGFBP
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3、LAP、NGF R、NrCAM、NT
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3、NT
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4、PAI
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1、TGF
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α、TGF
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β、TGF
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β3、TRAIL
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R4、ADAMTS1、组织蛋白酶S、FGF
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2、卵泡抑制素、半乳凝素
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7、GCP
‑
2、GDF
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15、IGFBP
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6、LIF、MMP
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9、pro
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MMP9、RANK、RANKL、RANTES、SDF
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1、CXCR4或
其任何组合。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂和所述捕获探针能够与同一分泌因子的不同表位结合。18.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂、所述捕获探针和所述锚定探针中的一种或更多种包括抗体或其片段，任选地所述抗体或其片段包括单克隆抗体，还任选地所述抗体或其片段包括Fab、Fab
’
、F(ab
’
)2、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD
‑
Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单特异抗体或其任何组合。19.根据权利要求1
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18中任一项所述的方法，其中所述捕获探针和/或所述锚定探针通过以下与所述第一固体支持物和/或所述第二固体支持物缀合：1,3
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偶极环加成反应、杂Diels
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Alder反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳
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碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合。20.根据权利要求1
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19中任一项所述的方法，其中所述表面细胞靶包括糖类、脂质、蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白或其任何组合。21.根据权利要求1
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20中任一项所述的方法，其中所述表面细胞靶包括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8b、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDwl2、CD13、CD14、CD15、CD15u、CD15s、CD15su、CD16、CD16b、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60a、CD60b、CD60c、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75s、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85a、CD85d、CD85j、CD85k、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD99R、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156a、CD156b、CD156c、CD157、CD158e、CD158i、CD158k、CD159a、CD159c、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167a、CD167b、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CDw198、CD199、CD200、CD201、CD202b、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210、CDw210b、CD212、
CD213a1、CD213a2、CD215、CD217a、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD239、CD240CE、CD240DCE、CD240D、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD286、CD289、CD290、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300a、CD300c、CD300e、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD308、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD344、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD360、CD361、CD362、CD363、CD364、CD365、CD366、CD367、CD368、CD369、CD370、CD371、BCMA、HLA蛋白、β2
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微球蛋白或其任何组合。22.根据权利要求1
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21中任一项所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸条形码与第三固体支持物关联，并且其中所述多于一个第二分区中的第二分区包含单个第三固体支持物。23.根据权利要求1
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22中任一项所述的方法，其中所述第一分区和/或第二分区是孔或液滴。24.根据权利要求1
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23中任一项所述的方法，其中每一种寡核苷酸条形码包含第一通用序列。25.根据权利要求1
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24中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸条形码包含靶结合区，所述靶结合区包含捕获序列，任选地所述靶结合区包含多(dT)区。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含与所述捕获序列互补的序列，所述捕获序列被配置为捕获所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸，任选地与所述捕获序列互补的序列包含多(dA)区。27.根据权利要求1
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26中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含所述第一通用序列的互补物。28.根据权利要求1
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27中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含第二通用序列。29.根据权利要求1
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28中任一项所述的方法，其中获得所述多于一个条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息包括：使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补物杂交的引物扩增所述多于一个条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物，以产生多于一个扩增的条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸；以及获得所述多于一个扩增的条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的测序数据。30.根据权利要求1
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29中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含第二分子标记。31.根据权利要求1
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30中任一项所述的方法，其中所述多于一个分泌因子结合试剂特
异性寡核苷酸中的至少10个包含不同的第二分子标记序列，任选地：(i)至少两个分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸的第二分子标记序列是不同的，并且其中所述至少两个分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸的独特标识符序列是相同的；或者(ii)至少两个分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸的第二分子标记序列是不同的，并且其中所述至少两个分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸的独特标识符序列是不同的。32.根据权利要求1
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31中任一项所述的方法，其中所述测序数据中与用于所述分泌因子结合试剂的独特因子标识符序列关联的独特第一分子标记序列的数目指示由所述一个或更多个单细胞中的每一个分泌的所述至少一种分泌因子的拷贝数，所述分泌因子结合试剂能够与所述至少一种分泌因子特异性结合。33.根据权利要求30
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32中任一项所述的方法，其中所述测序数据中与用于所述分泌因子结合试剂的独特因子标识符序列关联的独特第二分子标记序列的数目指示由所述一个或更多个单细胞中的每一个分泌的所述至少一种分泌因子的拷贝数，所述分泌因子结合试剂能够与所述至少一种分泌因子特异性结合。34.根据权利要求1
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33中任一项所述的方法，所述方法包括基于与所述多于一个条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记和/或第二分子标记的数目来确定由所述一个或更多个单细胞中的每一个分泌的所述至少一种分泌因子的拷贝数。35.根据权利要求29
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34中任一项所述的方法，所述方法包括基于与所述多于一个扩增的条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记和/或第二分子标记的数目来确定由所述一个或更多个单细胞中的每一个分泌的所述至少一种分泌因子的拷贝数。36.根据权利要求1
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35中任一项所述的方法，其中获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述多于一个条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物。37.根据权利要求1
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36中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含与所述多(dA)区相邻的对齐序列。38.根据权利要求37所述的方法，其中(a)所述对齐序列包含鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其组合；(b)所述对齐序列包含多(dT)序列、多(dG)序列、多(dC)序列、多(dU)序列或其组合；(c)所述对齐序列在所述多(dA)区的5
’
；和/或(d)所述对齐序列的长度为一个或更多个核苷酸，或长度为两个或更多个核苷酸。39.根据权利要求1
‑
38中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸通过接头与所述分泌因子结合试剂关联。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述接头包含碳链，任选地所述碳链包含2
‑
30个碳原子，并且还任选地所述碳链包含12个碳原子，任选地所述接头包含5
’
氨基修饰物C12(5AmMC12)或其衍生物。41.根据权利要求1
‑
40中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸被配置为可从所述分泌因子结合试剂脱离。42.根据权利要求1
‑
41中任一项所述的方法，所述方法包括使所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸与所述分泌因子结合试剂解离。
43.根据权利要求8
‑
42中任一项所述的方法，其中确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述核酸靶的拷贝数包括基于与所述多于一个条形码化核酸分子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记、其互补物或其组合的数目来确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述核酸靶的拷贝数。44.根据权利要求8
‑
43中任一项所述的方法，所述方法包括：使随机引物与所述多于一个条形码化核酸分子接触，其中所述随机引物中的每一种包含第三通用序列或其互补物；以及使与所述多于一个条形码化核酸分子杂交的所述随机引物延伸以产生多于一个延伸产物。45.根据权利要求44所述的方法，所述方法包括使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第三通用序列或其互补物杂交的引物扩增所述多于一个延伸产物，从而产生第一多于一个条形码化扩增子，任选地扩增所述多于一个延伸产物包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到所述多于一个延伸产物。46.根据权利要求45所述的方法，所述方法包括基于与所述第一多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述核酸靶的拷贝数。47.根据权利要求45
‑
46中任一项所述的方法，其中确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述核酸靶的拷贝数包括基于与所述第一多于一个条形码化扩增子中的条形码化扩增子关联的具有不同序列的所述第一分子标记的数目来确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述多于一个核酸靶中的每一个的数目，所述第一多于一个条形码化扩增子包含所述多于一个核酸靶中的每一个的序列，任选地所述多于一个核酸靶中的每一个的序列包括所述多于一个核酸靶中的每一个的子序列。48.根据权利要求45
‑
47中任一项所述的方法，其中所述第一多于一个条形码化扩增子中所述核酸靶的序列包括所述核酸靶的子序列。49.根据权利要求45
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48中任一项所述的方法，所述方法包括使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂...
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