本发明专利技术公开了一种用于黄曲霉毒素B1净化样品前处理的试剂盒，所述试剂盒包括免疫磁珠、提取液、缓冲液、淋洗液，本发明专利技术通过抗原抗体相互结合原理，特异性富集黄曲霉毒素B1，所述试剂盒是一种操作简单，成本低，可快速提取黄曲霉毒素B1净化样品前处理试剂盒。黄曲霉毒素B1净化样品前处理试剂盒。黄曲霉毒素B1净化样品前处理试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
一种花生油中黄曲霉毒素B1快速前处理试剂盒
[0001]本专利技术属于食品安全检测
，具体涉及花生油样品中黄曲霉毒素B1预处理试剂盒。
技术介绍
[0002]黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的次级代谢产物，主要包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2等多种毒素。其中黄曲霉毒素B1毒性最强，是砒霜毒性的64倍，被国际癌症研究机构定为I类致癌物。黄曲霉毒素极易污染粮油，我国GB2761
‑
2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》规定植物油脂中AFB1的限量为0.5～20μg/kg。鉴于食品中AFB1对人类健康具有巨大的潜在威胁，因此，迫切需要快速、简单的检测方法。
[0003]目前，检测AFB1的方法主要有液相色谱
‑
串联质谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法等。然而，检测食品中少量的黄曲霉毒素B1的关键步骤是从基质中将其进行提取和净化过程。为了消除食品样品中基质影响，已经开发了多种前处理技术来减少基质效应。例如液
‑
液萃取(LLE)、固相萃取(SEP)和免疫亲和层析(IAC)。LLE、SEP等方法耗时、复杂且需要大量有机溶剂。免疫亲和柱法虽不需要大量的有机溶剂，但用于常规分析时，操作复杂且昂贵，不适合大批量样品快速处理，因此建立简单实用的前处理方法具有重要的实践意义。
[0004]免疫磁性微球分离技术是纳米磁性微球与抗体结合的免疫学技术，不仅具备了免疫反应的高度专一性，同时兼有固相萃取的优点。其基本原理是将修饰在Fe3O4纳米磁性微球表面的官能团与抗体结合，构成免疫磁性微球。当施加外加磁场，纳米磁性微球会定向运动，从而实现快速分离，然后通过有机溶剂将被抗体捕获的检测物洗脱。与其他前处理技术相比，免疫磁性微球处理方法操作简单，可显著缩短前处理时间，为快速提取和检测花生和花生油中AFB1提供了机会。
技术实现思路
[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于免疫磁珠的黄曲霉毒素B1快速前处理试剂盒，快速富集提取黄曲霉毒素B1，所述免疫磁球具有操作简单且前处理用时短的特点。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]1.一种用于黄曲霉毒素净化样品前处理的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括免疫磁珠、提取液、缓冲液、淋洗液等几部分组成。免疫磁珠为免疫磁珠，提取液为样品前处理溶液，缓冲液为免疫磁珠与样品结合溶液，淋洗液主要用于洗脱反应结合物。
[0008]步骤主要包括以下：
[0009](1)样品提取
[0010]首先将样品中加入提取液，涡旋混匀，提取30分钟，离心获得上清液，取2mL上清液氮吹近干，用1mL缓冲液复溶以备下一步提取。
[0011](2)免疫磁珠富集提取AFB1
[0012]将步骤(1)中得到的缓冲液中加入免疫磁珠，旋转混匀，37℃下孵育5min，以实现最大程度地捕获样本中的黄曲霉毒素，磁分离，实现黄曲霉毒素样本的富集净化；去除磁分离后的上清，得到的沉淀即为捕获了黄曲霉毒素的免疫磁珠；
[0013](3)免疫磁珠的洗脱
[0014]将步骤(2)中得到的免疫磁珠中加入1mL淋洗液进行洗脱，室温震荡10分钟，磁分离，上清液即为富集净化后的黄曲霉毒素样本，可用于后续的测定。
[0015]2.根据权利要求1所述的一种应用免疫磁珠技术的黄曲霉毒素前处理试剂盒，其特征在于所述的免疫磁珠富集净化黄曲霉毒素的最佳反应条件为37℃。
[0016]3.根据权利要求1所述的一种应用免疫磁珠技术的黄曲霉毒素前处理试剂盒，其特征在于所述的采用的捕获缓冲液优选为pH＝7.4的PBS缓冲液。
[0017]优选的，提取液为体积比为70∶30的甲醇
‑
水溶液，提取液使用最佳体积为20mL。
[0018]优选的，免疫磁性微球用量为1.6mg。
[0019]优选的，免疫磁珠吸附样品中AFB1时间为5分钟。
[0020]优选的，淋洗液为甲醇，1mL甲醇为最佳洗脱体积，洗脱时间为10min时获得较好的洗脱效果。
[0021]4.根据权利要求1所述的一种应用免疫磁珠技术的黄曲霉毒素前处理试剂盒，其特征在于，优选地，步骤(1)中抗黄曲霉毒素抗体特异性免疫磁珠的具体制备方法为：
[0022]①
取1mL 10mg/mL的磁珠放入2mL离心管中，加入1mL 0.01M NaOH与磁珠混合均匀，进行活化，重复一次。磁分离弃去上清。
[0023](2)除去活化液后用1mL去离子水洗涤磁珠，磁分离弃去上清。并重复2次。
[0024](3)加入1mL反应缓冲溶液MES(100mM，pH＝5.5)，混合重悬。
[0025](4)磁分离弃去上清，加入300μL反应缓冲溶液，并加入活化剂EDC和NHS各100μL，混匀，于37℃震荡孵育0.5小时，进行磁珠活化。
[0026](5)磁分离弃去上清，用反应缓冲液快速洗涤磁珠2遍，加入50μL黄曲霉毒素B1抗体，再加入450μL MES，混匀，于37℃孵育2小时，制备成黄曲霉毒素抗体免疫磁珠；
[0027](6)磁分离弃去上清，加入1mL封闭缓冲液Tris
‑
HCl，37℃孵育1小时，磁分离弃去上清，加入1mL缓冲溶液PBST，置于4℃保存待用；
[0028]本专利技术相对于现有技术的有益效果是：
[0029]本研究建立的方法提取净化用时更短，且有机溶剂用量少，操作简便，能够满足大量样品快速检测。
附图说明
[0030]附图1一种花生油中黄曲霉毒素B1快速前处理试剂盒的结构示意图
[0031]附图标记说明1
‑
免疫磁珠，2
‑
提取液，3
‑
缓冲液，4
‑
淋洗液。
具体实施方式
[0032]下面通过实施例对本专利技术做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本专利技术，并不限制本专利技术的范围，本专利技术具体实施方式如下。
[0033]实施例1
[0034]一、抗黄曲霉毒素抗体免疫磁珠的制备：
[0035]1.取1mL 10mg/mL的磁珠放入2mL离心管中，加入1mL 0.01M NaOH与磁珠混合均匀，进行活化，重复一次。磁分离弃去上清。
[0036]2.除去活化液后用1mL去离子水洗涤磁珠，磁分离弃去上清。并重复2次。
[0037]3.加入1mL反应缓冲溶液MES(100mM，pH＝5.5)，混合重悬。
[0038]4.磁分离弃去上清，加入300μL反应缓冲溶液，并加入活化剂EDC和NHS各100μL，混匀，于37℃震荡孵育0.5小时，进行磁珠活化；
[0039]5.磁分离弃去上清，用反应缓冲液快速洗涤磁珠2遍，加入50μL黄曲霉毒素B1抗体，再加入450μL MES，混匀，于37℃孵育2小时，制备本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于黄曲霉毒素B1净化样品前处理的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括免疫磁珠、提取液、缓冲液、淋洗液等几部分组成。免疫磁珠为免疫磁珠，提取液为样品前处理溶液，缓冲液为免疫磁珠与样品结合溶液，淋洗液主要用于洗脱反应结合物。步骤主要包括以下：(1)样品提取首先将样品中加入提取液，涡旋混匀，提取30分钟，离心获得上清液，取2mL上清，氮吹近干，液用缓冲液复溶以备下一步提取。(2)免疫磁珠富集提取AFB1将步骤(1)中得到的缓冲液中加入免疫磁珠，旋转混匀，37℃下孵育5min，以实现最大程度地捕获样本中的黄曲霉毒素，磁分离，从而实现黄曲霉毒素样本的富集净化；去除磁分离后的上清，沉淀即为捕获了黄曲霉毒素的免疫磁珠；(3)免疫磁珠的洗脱将步骤(2)中得到的免疫磁珠中加入淋洗液进行洗脱，室温震荡10分钟，磁分离，上清液即为富集净化后的黄曲霉毒素B1样本，可用于后续的测定。2.根据权利要求1所述的一种应用免疫磁珠技术的黄曲霉毒素前处理试剂盒，其特征在于所述的免疫磁珠富集净化黄曲霉毒素的最佳反应条件为：免疫磁珠在缓冲液中的浓度采用1.6mg/mL，最佳温度为37℃，缓冲液为pH＝7.4的PBS缓冲液中孵育5min。3.根据权利要求1所述的一种应用免疫磁珠技术的黄曲霉毒素前处理试剂盒，其特征在于所述的采用的捕获缓冲液优选为pH＝7.4的PBS缓冲液。4.根据权利要求1所述的一种应用免疫磁珠技术的黄曲霉毒素前处理试...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘明珠，周焕英，王永辉，白家磊，高志贤，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。