【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于检测领域，具体地，涉及一种基于可编程dna镊子的超灵敏信号放大荧光传感检测方法，以及一种基于可编程dna镊子的超灵敏信号放大荧光传感器。
技术介绍
1、dna分子机器是一种由组装的dna结构制成的分子机器，可以在微观或纳米尺度上进行机器状的纳米机械运动，被广泛用于构建特殊纳米结构的分子模块。目前，已经开发出设计精良且功能强大的dna分子机器，包括“dna镊子”、“dna步行者”、“dna马达”和“dna机器人”等，它们在检测分析应用中具有巨大潜力。dna镊子是一类在功能上类似于宏观镊子的简单dna机器。由于其具有结构和响应机制简单，高可编程性和良好的生物相容性等独特的优势而经常被用作多功能生物传感器。目前，基于dna镊子生物传感技术已被设计并应用于检测核酸、蛋白质、小分子甚至细胞环境，并且表现出出色的检测性能。灵敏度对于生物传感至关重要，然而，dna镊子由于在信号响应过程中缺乏高效的信号放大策略导致其灵敏度有待进一步提高。
2、幸运地是，基于dna镊子的多功能性，允许使用各种信号放大策略提高灵敏度，以期待实现超灵敏、稳定、多重的检测效果。信号放大在提高生物传感器的灵敏度方面起着重要作用，为了获得更好的分析性能，实现对目标物的信号放大，已经开发了一系列等温扩增技术包括strand-displacement amplification(sda)，rolling circle amplification(rca)，loop-mediated isothermal amplification(lamp)，cat
技术实现思路
1、本专利技术的目的是设计了一种可编程的dna镊子，可实现对两种核酸序列的同时检测，由于dna镊子具有良好的可编程性，通过简单改造即可实现对真菌毒素的响应，通过进一步引入sda，结合sda对核酸序列卓越的扩增能力，构建了基于sda的dna镊子荧光传感体系，用于对目标物的高灵敏检测。
2、为了实现上述目的，本专利技术的第一方面提供一种基于可编程dna镊子的超灵敏信号放大荧光传感检测方法，该方法包括以下步骤：
3、(1)设计并制备适配体功能化磁性纳米颗粒：
4、所述适配体功能化磁性纳米颗粒为修饰有链霉亲和素磁性纳米颗粒，其上修饰有生物素化的适配体，所述适配体上杂交有与适配体互补配对的cdna，所述适配体包括第一检测目标的第一适配体和第二检测目标的第二适配体，所述cdna包括与第一适配体互补配对的第一cdna和与第二适配体互补配对的第二cdna；
5、(2)设计并制备发卡结构dna探针，所述探针能够与cdna互补配对从而使探针的发卡结构被打开，在探针3'端的单链片段能够与其原环序列的一部分杂交，从而形成另一种发夹结构，且该片段能够作为引物，在klenow片段聚合酶作用下实现延伸，所述另一种发夹结构的茎段具有一个切刻内切酶的限制性识别位点；所述探针包括与第一cdna匹配的第一探针和与第二cdna匹配的第二探针；
6、(3)设计并制备针对检测目标的dna镊子，所述dna镊子包括六条序列：
7、序列1的中间部分与序列2的中间部分形成第一杂交片段，杂交体作为dna镊子的两条双链臂；
8、序列3的两端分别修饰有第一荧光基团和第一猝灭基团，且序列3的首尾两段分别与序列1、序列2的同侧且靠近第一杂交片段的部分杂交，在杂交后第一猝灭基团能够猝灭第一荧光基团的荧光；
9、序列4的两端分别修饰有第二荧光基团和第二猝灭基团，且序列4的首尾两段分别与序列1、序列2的另一侧且靠近第一杂交片段的部分杂交，在杂交后第二猝灭基团能够猝灭第二荧光基团的荧光；
10、序列5的两个末端分别与序列1、序列2的同侧端部杂交，其中间序列设计为茎环结构，能够特异性地识别并结合第一cdna，当存在第一cdna时，茎环结构打开，使得第一荧光基团的荧光得以恢复；
11、序列6的两个末端分别与序列1、序列2的另一侧端部杂交，其中间序列设计为茎环结构，能够特异性地识别并结合第二cdna，当存在第二cdna时，茎环结构打开，使得第二荧光基团的荧光得以恢复；
12、(4)将待检测样品与步骤(1)制得的适配体功能化磁性纳米颗粒混合，然后经过磁分离，获得上清液；
13、(5)将步骤(4)得到的上清液与步骤(2)得到的发卡结构dna探针混合，加入klenow片段聚合酶和nb.bbvci切刻内切酶进行扩增，nb.bbvci切刻内切酶识别限制性识别位点后产生一个缺口，为klenow片段聚合酶产生新的复制位点，导致包含靶标的dna切口链序列被置换，置换的切口链打开另一个发夹模板探针以产生另一个扩增循环，实现对适配体的指数级扩增；
14、(6)将步骤(5)得到的扩增产物加入到步骤(3)设计的dna镊子体系中，然后进行荧光检测。
15、根据本专利技术一种优选实施方式，所述第一荧光基团和第一猝灭基团分别为fam和bhq1；所述第二荧光基团和第二猝灭基团分别为cy5和bhq2。
16、根据本专利技术一种优选实施方式，所述第一检测目标为霉菌毒素afb1，所述第二检测目标为霉菌毒素zen；所述第一检测目标的适配体的序列为seq id no：1所示，所述第二检测目标的适配体序列为seq id no：2所示；所述第一cdna的序列为seq id no：3所示，所述第二cdna的序列为seq id no：4所示；所述第一探针的序列为seq id no：5所示，所述第二探针的序列为seq id no：6所示。
17、根据本专利技术一种优选实施方式，所述dna镊子由序列1～序列6等比例混合制备，序列1～序列6的核苷酸序列分别为seq id no：7～seq id no：12所示(见表1)。
18、本专利技术对步骤(5)中扩增条件进行了优化，发夹结构dna探针的浓度为35-45nm，最优选为40nm，klenow fragment的加入量为1-1.5μl，最优选为1.25μl，扩增时间为35-45min，最优选为40min。
19、根据本专利技术，步骤(6)中，荧光检测的条件可包括：在475nm和640nm的激发波长下检测500-600nm和本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于可编程DNA镊子的超灵敏信号放大荧光传感检测方法，该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一荧光基团和第一猝灭基团分别为FAM和BHQ1；
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一检测目标为霉菌毒素AFB1，所述第二检测目标为霉菌毒素ZEN；
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA镊子由序列1～序列6等比例混合制备，序列1～序列6的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：12所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(5)中，发夹结构DNA探针的浓度为35-45nM，Klenow fragment的加入量为1-1.5μL，扩增时间为35-45min。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(6)中，荧光检测的条件包括：在475nm和640nm的激发波长下检测500-600nm和660-730nm的荧光光谱，激发狭缝宽度为20nm，发射狭缝宽度为10nm，电压为900V。
7.一种基于可编程DNA镊子的超灵敏信号放大荧光传感器，包括以下部分
8.根据权利要求7所述的基于可编程DNA镊子的超灵敏信号放大荧光传感器，其中，所述第一荧光基团和第一猝灭基团分别为FAM和BHQ1；
9.根据权利要求7所述的基于可编程DNA镊子的超灵敏信号放大荧光传感器，其中，所述第一检测目标为霉菌毒素AFB1，所述第二检测目标为霉菌毒素ZEN；
10.根据权利要求7所述的基于可编程DNA镊子的超灵敏信号放大荧光传感器，其中，所述DNA镊子由序列1～序列6等比例混合制备，序列1～序列6的核苷酸序列分别为SEQ IDNO：7～SEQ ID NO：12所示。
...【技术特征摘要】
1.基于可编程dna镊子的超灵敏信号放大荧光传感检测方法，该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一荧光基团和第一猝灭基团分别为fam和bhq1；
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一检测目标为霉菌毒素afb1，所述第二检测目标为霉菌毒素zen；
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述dna镊子由序列1～序列6等比例混合制备，序列1～序列6的核苷酸序列分别为seq id no：7～seq id no：12所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(5)中，发夹结构dna探针的浓度为35-45nm，klenow fragment的加入量为1-1.5μl，扩增时间为35-45min。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(6)中，荧光检测的条件包括：在47...
【专利技术属性】
技术研发人员：高志贤，任舒悦，周焕英，杨迎澳，张锐，陈瑞鹏，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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