【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于真菌毒素检测领域，具体地，涉及一种三维dna纳米镊子、一种基于三维dna纳米镊子结合sers传感器及其制备方法，与一种赭曲霉毒素检测方法。
技术介绍
1、真菌毒素(mycotoxins)是由某些特定类型的真菌(霉菌)合成的具有多种化学结构的次级有毒代谢产物，在不同的基质中，例如谷物、饲料和草药等，都可能造成真菌毒素的污染，不但降低产品质量，造成严重的经济损失，还威胁到消费者的健康。由于其种类庞杂、分布广泛、危害巨大，世界各国都高度关切真菌毒素的污染问题，对于各国的农作物污染比例，已经上升至四分之一，有研究指出，全球约25％的作物受到真菌毒素的污染，相关经济损失估计达数十亿美元。目前已鉴定出400多种真菌次级代谢产物，而只有约30种真菌毒素对人类健康和牲畜具有真正的毒性。真菌毒素可以在生产、加工、运输和储存的任何阶段通过许多污染途径在食品和农产品中产生，且大多数真菌毒素化学结构稳定，可以在食品加工过程中保持其毒性。真菌毒素污染已成为危害我国粮食安全粮油国际贸易的重要因素之一。
2、目前已知会产生真菌毒素的最常见霉菌类型是曲霉菌(aspergillus)、青霉菌(penicillium)、镰刀菌(fusarium)和链霉菌(alternaria)。其中，具有代表性的真菌毒素有黄曲霉毒素(aflatoxins，aft)、赭曲霉毒素(ochratoxin，ota)、伏马毒素(fumonisin，fb)、玉米赤霉烯酮(zearelenone，zon)等。赭曲霉毒素主要是由某些曲霉菌和青霉菌在特殊的温度和湿度条件下
3、为了严格控制食品和饲料中的ota，减少对人体和动物健康的伤害，目前已开发了多种ota的检测方法，常用方法主要包括色谱法和免疫分析方法。色谱法主要包括薄层色谱法(thin layer chromatography，tcl)、高效液相色谱法(high performance liquidchromatography，hplc)和液相色谱－质谱联用法(liquid chromatograph tandemspectrometry，lc-ms/ms)。免疫分析法是基于抗体与抗原的识别分析检测方法，用于ota检测的免疫分析法主要是酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)，侧流免疫分析(lateral flow immunoassay，lfia)和胶体金免疫层析法(colloidal gold immunochromatography，gic)等。但是色谱法操作耗时繁琐、设备昂贵且需要专业技术人员，所以不适合对真菌毒素进行大量和现场检测。免疫分析法制备ota单抗耗时较长；当毒素的类似物同时存在则会出现假阳性的试验结果，致使检测结果不准确。近年来，由于核酸适配体具有特异性强、可通过体外合成、制备简单、稳定性好、没有免疫源性和毒性等优势，以适配体作为识别元件的多种检测途径在ota检测方面得到了应用。表面增强拉曼散射(sers)是一种快速检测技术，克服了常用检测技术的一些局限性。它携带了大量的化学指纹信息，具有灵敏度高、荧光背景低、不受水的干扰、可进行痕量无损检测、便携等优点。sers检测技术可分为两类：直接检测技术和间接检测技术。由于ota和sers底物之间的吸附较弱，直接检测技术的灵敏度和选择性往往较低。在sers检测方法中，制备具有高稳定性、高灵敏度、高反应性和均匀性的sers活性底物是sers检测技术的基础。在贵金属表面标记sers信号分子，可以显著增强sers信号强度，降低数据处理难度；此外，通过在金属表面组合适体形成sers标签，可以提高间接检测技术的灵敏度。表面增强拉曼光谱(surface enhanced raman scattering，sers)技术的出现及不断创新，使得拉曼光谱技术在表面科学中的应用迅速崛起。
4、因此，本领域仍需开发一种快速、简便、灵敏的ota检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术设计了一种四面体状的三维dna纳米镊子，通过目标物ota与其对应的适配体之间的生物性识别控制dna纳米镊子的“打开”和“闭合”，实现表面增强拉曼信号强度的减弱和增强。基于核酸适配体检测技术结合表面增强拉曼传感实现对农产品中ota的检测。
2、为了实现上述目的，本专利技术的第一方面提供一种三维dna纳米镊子，包括如下组分：
3、(1)金纳米粒子：
4、(2)dna单链p1、p2、p3、p4、p5，其中，
5、p1的序列为seq id no：1所示，p2的序列为seq id no：2所示，p3的序列为seq idno：3所示，p5的序列为seq id no：4所示；
6、p4的两端具有巯基修饰，其序列包括5’侧翼、中部和3’侧翼，所述5’侧翼的序列为seq id no：5所示，所述3’侧翼的序列为seq id no：6所示，所述中部为18个核苷酸的dna序列。
7、根据本专利技术，优选地，p4与金纳米粒子颗粒以dna-aunps的形式存在，所述三维dna纳米镊子由dna-aunps与dna单链p1、p2、p3、p5相互杂交并退火形成。
8、根据本专利技术一种优选实施方式，所述中部为检测目标的适配体的互补序列；优选地，所述中部的序列为seq id no：7所示。
9、基于dna nanotweezer-aunps探针检测ota的示意图如图1所示，由5条dna单链相互杂交并通过退火过程形成闭合的三维dna纳米镊子结构，其中p4的中间部分是ota适配体的互补链，我们把它设计成了茎环结构，这样可以拉近三维dna纳米镊子两臂之间的距离，使其更好的呈现闭合状态。p4末端是通过巯基连接的修饰有拉曼信号分子的金纳米颗粒，当不存在目标物时，加入适配体后，dna纳米镊子处于“打开”状态，两个aunps之间存在较大的距离，这会导致产生较弱的拉曼信号。当加入目标物之后，通过目标物与适配体的特异性识别作用，可以使三维dna纳米镊子仍然保持闭合状态，此时两个aunps之间的间距大大缩短，从而引起拉曼信号的增强，因此，可以通过检测拉曼信号的变化实现ota的定量检测。
10、本专利技术的第二方面提供一种基于三维dna纳米镊子结合sers传感器，包括如下组分：
11、(1)上述的三维dna纳米镊子；
12、(2)拉曼信号分子。
13、根据本专利技术一种优选实施方式，所述拉曼信号分子为4-巯基苯甲酸。
14、本专利技术的第本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种三维DNA纳米镊子，包括如下组分：
2.根据权利要求1所述的三维DNA纳米镊子，其中，P4与金纳米粒子颗粒以DNA-AuNPs的形式存在，所述三维DNA纳米镊子由DNA-AuNPs与DNA单链P1、P2、P3、P5相互杂交并退火形成。
3.根据权利要求1所述的三维DNA纳米镊子，其中，所述中部为检测目标的适配体的互补序列；优选地，所述中部的序列为SEQ ID NO：7所示。
4.一种基于三维DNA纳米镊子结合SERS传感器，包括如下组分：
5.根据权利要求4所述的基于三维DNA纳米镊子结合SERS传感器，其中，所述拉曼信号分子为4-巯基苯甲酸。
6.权利要求4-5中任意一项所述的基于三维DNA纳米镊子结合SERS传感器的制备方法，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(1)包括：将1μM两端修饰有巯基的DNA单链P4与0.25mM AuNPs按照体积比1:10混合，置于-20℃条件下冷冻两个小时，然后在室温下解冻得到DNA-AuNPs；
8.一种基于三维DNA纳米镊子结合
9.一种赭曲霉毒素检测方法，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的检测方法，其中，
...【技术特征摘要】
1.一种三维dna纳米镊子，包括如下组分：
2.根据权利要求1所述的三维dna纳米镊子，其中，p4与金纳米粒子颗粒以dna-aunps的形式存在，所述三维dna纳米镊子由dna-aunps与dna单链p1、p2、p3、p5相互杂交并退火形成。
3.根据权利要求1所述的三维dna纳米镊子，其中，所述中部为检测目标的适配体的互补序列；优选地，所述中部的序列为seq id no：7所示。
4.一种基于三维dna纳米镊子结合sers传感器，包括如下组分：
5.根据权利要求4所述的基于三维dna纳米镊子结合sers传感器，其中，所述拉曼信号分子为4-...
【专利技术属性】
技术研发人员：高志贤，任舒悦，周焕英，张锐，杨迎澳，陈瑞鹏，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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