一种MDR1的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种MDR1的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂,其特征在于：PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ?NO1、SEQ?NO2，其序列为：SEQ?NO1：GCAATAGCAGGAGTTGTTGAA；SEQ?NO2：Biotin-TCTTAGAGCATAGTAAGCAGTAGG；测序试剂包括特异性测序引物SEQ?NO3，其序列为：SEQ?NO3：GATAAGAAAGAACTAGAAGG。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生命科学和生物
，特别是一种MDRl的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂盒，采用基因测序技术，可以对MDRl (G2677T/A)多态性位点进行检测。
技术介绍
多药耐药基因I (multidrug resistance gene I, MDRl)位于人类染色体7q21. Γ21. 12，基因全长约209kb。MDRl 21外显子上的错义突变G2677T/A造成基因产物的氨基酸发生变化，丙氨酸(Ala)转变为丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)，使得该基因的表达和功能发生改变。MDRl的G2677T/A的多态性包括了以下6种GG型(野生纯合型)、GT型 (杂合型)、GA型(杂合型)、AT型(突变杂合型)、TT型(突变纯合型)、AA型(突变纯合型)。多药耐药(MDR)是导致肿瘤化疗失败及多种疾病预后差的重要原因之一，而P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)机制是多药耐药的主要原因之一。Ρ-gp是I个由MDRl基因编码的分子量为170kD的细胞膜糖蛋白，具有广泛的作用底物，P-gp 一旦与抗肿瘤药物结合，便通过ATP提供能量，将药物从胞内泵出胞外，同时P-gp还能增加小肠壁对药物的排除从而造成耐药。G2677T/A的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与P-gp活性的关系最为密切，且诸多研究表明G2677T/A影响了包括化疗药物、免疫抑制剂等许多药物的药代谢动力学，并与许多恶性肿瘤的发生、预后相关。于庆忠等在研究肺癌患者MDR1G2677T/A与钼类化疗疗效的相关性时发现，携带至少I个T等位基因的患者的化疗有效率2. 8%要显著低于其他基因型患者的58. 1% ；Kmi等对急性髓细胞性白血病患者的研究发现，G2677G的白血病患者的完全缓解率要明显高于携带其他基因型的患者；Kurata等在研究中发现G2677GG个体服用单剂量地高辛后，血清药物浓度低于G2677GT或者是 G2677TT个体；唐惠林等的研究表明，在844例肾病患者中，GG基因型患者的Csk剂量调整谷浓度明显低于其他基因型患者，同时GG基因型患者的给药后2h剂量调整浓度及平均日剂量与(TT+TA+AA)基因型患者之间有显著差异。因此，了解患者及不同人群中G2677T/A基因型情况，有助于临床医生更好地针对个体或群体的差异制定相关治疗方案和选择合适的药物及剂量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种检测MDRl的G2677T/A单核苷酸多态性的试剂盒，可用于检测MDRl (G2677T/A)位点是否发生突变。一种MDRl的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂，其特征在于PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ NOUSEQ NO 2，其序列为SEQ NO IGCAATAGCAGGAGTTGTTGAA,SEQ N02 Biot i n-TCTTAGAGCATAGTAAGCAGTAGG ；测序试剂包括特异性测序引物SEQ N03，其序列为SEQ N03 GATAAGAAAGAACTAGAAGG 进一步地，所述PCR试剂包括2*PCR BufTerUOmM dNTP、5U/ul Taq酶、特异性扩增引物SEQ NOl和SEQ NO 2、灭菌水；所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70%(V/V)乙醇、变性液、I XWash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。所述试剂盒的使用方法包括如下步骤(I)提取样本中的DNA(2)以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(SEQ NOUSEQ NO 2)进行PCR扩增；(3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化； (4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行测序；(5)结果分析。进一步地，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增94°C 2min预变性；98°C 10s、58°C 30s,68°C 30s, 38 个循环；68°C 5min。步骤(3)单链纯化的具体步骤为将得到的50ul PCR产物与3ul链亲和素包被的磁珠及47ul结合缓冲液混合，室温孵育l(Tl5min，期间震荡2 3次，然后使用Vaccuumprep tool吸取磁珠,将带有磁珠的Vaccuum prep tool先后放进70% (V/V)乙醇、变性液、 I Xffash Buffer中清洗IOs左右，再将Vaccuum prep tool放入含有49ul退火缓冲液及Iul测序引物(SEQ N03)的96孔板中，释放磁珠，将该96孔板放置于80°C 2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。步骤(5)结果分析的具体方法是将测序结果与标准序列对比，得到MDRl 2677位点的碱基类型。MDRl 部分标准序列为TTGGGACAGGAATAATTATATCCTTCATCTATGGTTGGCAACTAACACTGTTACTCTTAGCAATTGTACCCATCATTGCAATAGCAGGAGTTGTTGAAATGAAAATGTTGTCTGGACAAGCACTGAAAGATAAGAAAGAACTAGAAGGTGCTGGGAAGGTGAGTCAAACTAAATATGATTGATTAATTAAGTAGAGTAAAGTATTCTAATCAGTGTTATTTTGTTACTCCCTACTGCTTACTATGCTCTAAGAATGTGTTTATAACCATTCCTCAAAGCAATCTTTTTCATGCTTATT。其中下划线部分为2677位点。本专利技术的有益效果目前，对于检测MDRl的G2677T/A多态性的最可靠的方法就是进行测序，而本专利技术通过特异性引物扩增目的区域，并利用焦磷酸测序分析鉴定多态性。该方法不但保证了一定的准确性及灵敏度，同时相对Sanger测序法具备了较短的检测周期，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。附图说明图I是样本A测序图。测序结果为T￡CTGGGAAGGTGAGTCAAA，该样本是GG型(野生型)，图中方框部分是样本A基因型的判断区。图2是样本B测序图。测序结果为:TG (A)CTGGGAAGGTGAGTCAAA,该样本是GA型(杂合型)，图中方框部分是样本B基因型的判断区。图3是样本C测序图。测序结果为TG (T)CTGGGAAGGTGAGTCAAA,该样本是GT型(杂合型)，图中方框部分是样本C基因型的判断区。图4是样本D测序图。测序结果为:TT (A)CTGGGAAGGTGAGTCAAA,该样本是TA型(突变杂合型)，图中方框部分是样本D基因型的判断区。图5是样本E测序图。测序结果为TICTGGGAAGGTGAGTCAAA，该样本是TT型(突变纯合型)，图中方框部分是样本E基因型的判断区。图6是样本F测序图。测序结果为TACTGGGAAGGTGAGTCAAA，该样本是AA型(突变纯合型)，图中方框部分是样本F基因型的判断区。图疒12分别是样本么、8、(、03、？的犯叩虹测序图谱。目的是为验证图2 7的结果，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MDR1的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂,其特征在于：PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ？NO1、SEQ？NO？2，其序列为：SEQ？NO1：GCAATAGCAGGAGTTGTTGAA，SEQ？NO2：Biotin？TCTTAGAGCATAGTAAGCAGTAGG；测序试剂包括特异性测序引物SEQ？NO3，其序列为：SEQ？NO3：GATAAGAAAGAACTAGAAGG。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈奕磊，徐建成，王淑一，孙翠莲，
申请(专利权)人：吉林艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：