本发明专利技术涉及一种木尔坦棉花曲叶病毒侵染性载体的构建方法。以木尔坦棉花曲叶病毒为材料对基因组DNAA和卫星DNAβ进行了侵染性克隆的构建，通过2种构建策略，将1.9个正向重复的基因组DNAA和1.8个正向重复的卫星DNAβ分别或者同时构建在具有高度复制能力的植物表达载体pCambia2300上，重组载体通过电击的方法导入农杆菌菌株，获得以农杆菌介导的对寄主植物具有高效侵染能力的病毒载体。本发明专利技术为研究病毒基因组结构与功能、寄主与病毒之间的互作、以及通过病毒诱导的基因沉默用以研究植物功能基因组提供了成熟的方法和体系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及棉花DNA病毒侵染性载体构建方法。
技术介绍
棉花曲叶病(Cotton leaf curl disease)是一种在印度半岛地区严重危害棉花生产的病害。棉花曲叶病主要由双生病毒引起，经烟粉虱传播，典型的症状是植株叶片向 上或向下卷曲、叶脉颜色加深、叶背面叶脉膨大和耳突增生，形成杯状侧叶，植株矮化，棉纤维低产，棉铃少结或不结，可造成严重减产，甚至绝收。木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leafcurl Multan virus, CLCuMV)是引起棉花曲叶病的主要病原。木尔坦棉花曲叶病毒属双生病毒科(Geminiviridae)中的菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus),具有典型的双联体颗粒形态，大小约18 20 nmX 30 nm,基因组含有DNA A和卫星DNA β分子，并形成CLCuMV/DNA β病害复合体。CLCuMV DNA A编码AV2，AVl，AC3, AC2, ACl，AC4共6个蛋白，分别是外壳前体蛋白，外壳蛋白，复制增强蛋白，转录激活蛋白，复制蛋白和转录调控蛋白。卫星DNA β基因组大小是DNA A分子的一半，与DNA A没有序列同源性，DNA β分子只编码一个致病因子PCI。DNA A和 ΝΑβ在寄主体内是一种互补的关系，DNA A能够系统侵染植株，但是单独不能引发典型的症状，只有当DNAii存在时，植株才能引发典型的病毒病症状，并且DNAii能够大大促进DNA A在植株中的积累量，而DNAii不能独立复制，它必须依赖于DNA A进行复制、移动及介体传播。双生病毒正在全球范围内日益猖撅危害，已有40多个国家的棉花、番茄、木薯和烟草等作物遭受此类病毒的毁灭性危害。尤其是双生病毒DNA与卫星DNAii形成的病害复合体正在快速扩展它的地理分布和寄主范围。我国也已在云南、广西、广东、福建、海南、北京、上海等17个省市的烟草、番茄、番木瓜和南瓜等作物以及假马鞭、胜红蓟、稀硷等杂草上发现了 40多种双生病毒，且多数为双生病毒DNA与卫星DNA β形成的病害复合体，并呈扩展蔓延的趋势。这一病害复合体在全球范围广泛存在并逐年加重，其地理分布和寄主范围迅速扩展，且近年来粉虱介体在全球范围内的大爆发，加上生产上单一品种的大规模种植，这类病害复合体一旦传入新的地区，将会给当地农业生态系统带来巨大的威胁。CLCuMV是在广东地区表现为曲叶症状的扶桑上分离得到的，其病毒全长基因组序列与木尔坦棉花曲叶病毒Nanning、G6和0kra06分离物的同源性达到99%以上。CLCuMV是不能机械传播的双生病毒，为了明确CLCuMV和卫星DNAii在致病中的作用，以及研究CLCuMV基因组功能，必须构建CLCuMV的侵染性克隆。目前，利用植物病毒接种植物的方法主要有三种。第一是利用机械摩擦的方法，该方法只适用于可以机械传播侵染的植物病毒，如烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒，而绝大多数双生病毒因不能机械传播因而无法应用该方法侵染植物。第二种是基因枪轰击的方法，该方法操作简便，但效率低，且整套设备与金粉等耗材价格昂贵，不便于推广。最后一种是基于农杆菌介导的方法。该方法首先在dsDNA病毒中的花椰菜花叶病毒中成功应用，并逐渐被应用于双生病毒，它是一种简易，有效的方法。本专利技术是以木尔坦棉花曲叶病毒为材料来建立侵染性载体构建的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种木尔坦棉花曲叶病毒侵染性载体的构建方法，包括如下步骤 1)从采集的感染木尔坦棉花曲叶病毒的棉花中提取植物基因组总DNA； 2)以该植物基因组总DNA为模板，设计病毒全长特异引物GXAsail F :5’ -GGTCGACGTCATCAATGACGTTGTA-3 和 GXA sail R :5’ -ACGTCGACCCGCATTTCCTCAAA-3’对木尔坦棉花曲叶病毒的DNA A进行PCR扩增，扩增产物克隆至T-Vector ;同时，设计卫星 DNA β 特异引物 betaOl :5’-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’ 和 beta02 5’ -GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3’对木尔坦棉花曲叶病毒的卫星DNA β分子进行PCR扩增，扩增产物克隆至T-Vector ； 3)对克隆产物进行阳性克隆的筛选并进行DNA序列测定； 4)DNA序列测定结果通过DNAStar分析软件进行组合、拼接，获得木尔坦棉花曲叶病毒的DNA A组份和木尔坦棉花曲叶病毒的DNAii的全长基因组序列； 5)木尔坦棉花曲叶病毒侵染性载体构建在测序结果基础上，利用分子生物学方法把木尔坦棉花曲叶病毒的DNA A组份的I. 9个正向重复的基因组构建到改良型植物表达载体pCambia2300上，获得带有DNA A组份的重组植物表达载体pCambia-1. 9A，并将其导入到大肠杆菌；利用限制性酶切的方法把I. 8个正向重复的木尔坦棉花曲叶病毒的DNA β构建到改良型植物表达载体pCambia2300上，获得带有DNA β的重组植物表达载体pCambia-1. 8 β ,并将其导入到大肠杆菌； 或在测序结果基础上，利用分子生物学方法把木尔坦棉花曲叶病毒的DNA A组份的I. 9个正向重复和木尔坦棉花曲叶病毒的卫星DNAP的I. 8个正向重复构建到同一个改良型植物表达载体pCambia2300上，获得带有木尔坦棉花曲叶病毒的DNA A和卫星 ΝΑβ的重组植物表达载体pCambia-1. 9A-1. 8 β，并将其导入到大肠杆菌； 6)通过电击的方法将上述重组植物表达载体pCambia-1.9A、pCambia-1. 8 β或pCambia-1. 9A-1. 8 β分别导入农杆菌菌株ΕΗΑ105 ； 7)接种前的菌液处理上述3种带有木尔坦棉花曲叶病毒重组植物表达载体的农杆菌分别接种20 mL YEP双抗液体培养基，28°C 220rpm摇菌培养至0D600为O. 8-1. 2 ;经12000rpm I分钟离心，弃上清，用含10 mM MgCl2,10 mM MES, 200 mM乙酰丁香酮的浸润缓冲液重新悬浮菌体，调整0D600为I. O左右，静置2-3小时后浸润植物备用； 8)浸润接种选用4-6叶充分展开的苗龄期的植株，利用不带针头的Iml注射器在3-4周的植物叶片背面进行浸润一株植物一般接种3-4片叶子；侵染性测定时； 9)接种植株置于25°C隔离温室培养，10天后观察接种植株的症状，对有症状和没有症状的接种植株进行PCR和Southern blot检测以鉴定其侵染性及病毒积累量。所述的农杆菌介导的木尔坦棉花曲叶病毒侵染性克隆用于木尔坦棉花曲叶病毒的致病性测定、病毒基因功能研究、棉花抗性品种的鉴定和培育或寄主植物、传毒介体与病毒三者之间的互作研究。本专利技术的有益效果 O传统的农杆菌介导法使用pBinplus，这个载体复制量小，加上本身质粒大，对其进行重组克隆时不易操作，本专利技术使用对其复制起始位点经过改良的植物表达载体pCambia2300，其复制量大大加强，并且感染植物的效率也大大增加。在这个改良型载体上也可以直接进行简单方便的操作。2)本专利技术采用2种构建策略，将病毒的DNA A和DNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种木尔坦棉花曲叶病毒侵染性载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：1）从采集的感染木尔坦棉花曲叶病毒的棉花中提取植物基因组总DNA；2）以该植物基因组总DNA为模板，设计病毒全长特异引物GXA？sal1？F：5’？？GGTCGACGTCATCAATGACGTTGTA？3和？GXA？sal1？R：5’？ACGTCGACCCGCATTTCCTCAAA？3’对木尔坦棉花曲叶病毒的DNA？A进行PCR扩增，扩增产物克隆至T？Vector；同时，设计卫星DNAβ特异引物beta01：5“？GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC？3“和beta02：5“？GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC？3“对木尔坦棉花曲叶病毒的卫星DNAβ分子进行PCR扩增，扩增产物克隆至T？Vector；3）对克隆产物进行阳性克隆的筛选并进行DNA序列测定；4）DNA序列测定结果通过DNAStar分析软件进行组合、拼接，获得木尔坦棉花曲叶病毒的DNA？A组份和木尔坦棉花曲叶病毒的DNAβ的全长基因组序列；5）木尔坦棉花曲叶病毒侵染性载体构建：在测序结果基础上，利用分子生物学方法把木尔坦棉花曲叶病毒的DNA？A组份的1.9个正向重复的基因组构建到改良型植物表达载体pCambia2300上，获得带有DNA？A组份的重组植物表达载体pCambia？1.9A,？并将其导入到大肠杆菌；利用限制性酶切的方法把1.8个正向重复的木尔坦棉花曲叶病毒的DNAβ构建到改良型植物表达载体pCambia2300上，获得带有DNAβ的重组植物表达载体pCambia？1.8β,？并将其导入到大肠杆菌；或在测序结果基础上，利用分子生物学方法把木尔坦棉花曲叶病毒的DNA？A组份的1.9个正向重复和木尔坦棉花曲叶病毒的卫星DNAβ的1.8个正向重复构建到同一个改良型植物表达载体pCambia2300上，获得带有木尔坦棉花曲叶病毒的DNA？A和卫星DNAβ的重组植物表达载体pCambia？1.9A？1.8β,？并将其导入到大肠杆菌；6）通过电击的方法将上述重组植物表达载体pCambia？1.9A、pCambia？1.8β或pCambia？1.9A？1.8β分别导入农杆菌菌株EHA105；7）接种前的菌液处理：上述3种带有木尔坦棉花曲叶病毒重组植物表达载体的农杆菌分别接种20？mL？YEP双抗液体培养基，28℃？220rpm摇菌培养至OD600为0.8？1.2；经12000？rpm？1分钟离心，弃上清，用含10？mM？MgCl2，10？mM？MES，200？mM？乙酰丁香酮的浸润缓冲液重新悬浮菌体，调整OD600为1.0左右，静置2？3小时后浸润植物备用；8）浸润接种：选用4？6叶充分展开的苗龄期的植株，利用不带针头的1？ml注射器在？3？4周的植物叶片背面进行浸润一株植物一般接种3？4片叶子；侵染性测定时；？9）接种植株置于25℃隔离温室培养，10天后观察接种植株的症状，对有症状和没有症状的接种植株进行PCR和Southern？blot检测以鉴定其侵染性及病毒积累量。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周雪平，顾周杭，谢艳，胡高洁，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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