一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法技术

本发明专利技术提供了一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法，其是用悬浮于AAM-AS培养基中的根癌农杆菌(Agrobacterium?tumefaciens)侵染日本结缕草的愈伤组织，将侵染后的愈伤组织置于N6D2-AS培养基中共培养2-3天，最后洗去根癌农杆菌，筛选并培养愈伤组织。本发明专利技术针对农杆菌介导日本结缕草遗传转化体系影响转化效率的三大重要影响因子，摸索出最佳菌液浓度(OD600值为0.3-0.4)，侵染时间(1.5-2h)及共培养时间(2-3天)。结合培养基的改良，最终转化效率达到50％以上；另外，本发明专利技术通过改进农杆菌清洗方法，使在筛选培养的过程中排除了农杆菌的污染，与以往的农杆菌介导转化方法相比，大大减少了工作量，节约了成本，避免了愈伤材料的浪费。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术基因工程领域，具体地说，涉及。
技术介绍
日本结缕草(Zoysia Japonica Steud.)是我国资源丰富的唯一不需要进口的草坪草种，具有适应性强，耐旱、抗热、抗寒、耐践踏和耐贫瘠等许多优良性状。其缺点主要是发芽迟缓，出苗成坪慢，导致易被杂草侵占。所以，一般育种目标都集中在延长绿期，提高其质地和耐寒性，加快苗期生长、发芽速率等方面，但在这方面的研究很少，国内外只在打破种子休眠上做了一些基本的研究。由于植物抗逆性本身的复杂性和其数量性状位点连锁关系的复杂性使得利用传统育种方法获得优良的抗性品种十分困难，利用基因工程技术获得适应或抵抗这些不利环境因素的草坪草品种将是解决这些问题快速且有效的方法之一。近 20年来，随着植物分子生物学和基因工程方面的研究进展，尤其是转基因技术在禾本科作物育种中的发展，近年来，草坪草转基因技术方面发进展迅速。农杆菌介导转化法的原理是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染植物时，独立于其染色体外的Ti质粒的一段DNA(T-DNA)可以转入植物细胞，并稳定地保留在植物细胞染色体中，变为植物细胞新增加的一群基因，最终能通过有性世代遗传给子代(Matthews等，2001)。两者的主要过程包括含目的基因的重组质粒导入农杆菌一农杆菌与转化受体共培养一转化受体的处理一转化体的筛选和再分化植株一拟转化植株的分子检测与遗传稳定性研究。它介导的转化频率高，再生植株可育率高，可转移圈套片段DNA，不需要原生质体培养技术，导入的外源基因拷贝数较低，所需实验条件简单，价格低，有人认为它是一种“天然”的转化方法，可能有助于避免基因沉默。另外，添加乙酰丁香酮、葡萄糖、没食子酸等的改良农杆菌介导法在水稻等单子叶植物已进行广泛的研究，并获得了较高的转化频率。早先的研究认为双子叶植物是农杆菌的天然宿主，单子叶植物很难用农杆菌侵染，但随着农杆菌介导转化法在小麦(Deng等，1988)和水稻(Chan等，1993)上相继成功的应用，近年来也在草坪草转基因育种中获得成功。最早是由Rosset等人1998年(Rosselt等，1998)报道的，在多年生黑麦草和多花黑麦草都被成功转化，潮霉素抗性率为I. 7% -4. 5%,标志着农杆菌介导转化法在草坪草遗传转化上的突破。随后,农杆菌介导转化法在匍匍翦股颖(Chai等,2000 ；Luo等,2004 ；Fu等,2005 ；Han等,2005)、细弱翦股颖(Chai 等,2000 ；2004)、鸭茅(Lee 等,2000)、结缕草(Chai 等,2000 ；Toyama 等,2003)、高羊茅(Lee, 2000 ；Bettany 等，2003 ；Lee 等，2004 ；ffang 等，2005)、多年生黑麦草(Bettany 等，2003)、草地早熟禾(Chai等，2003)等多种草坪草的研究中也获得成功。虽然农杆菌介导转化法在以上草种中已经获得转基因植株，但还存在着对基因型的限制。单子叶植物难以用农杆菌感染的原因主要是(叶健明，1999;郭殿京，1997):①单子叶植物很少或完全不能产生激活Ti质粒Vir区基因的信号分子单子叶植物转化的靶组织或细胞不能进行有效的细菌粘附，无明显的创伤反应，不能诱导创伤附近的细胞脱分化形成大量感受态细胞，而只有那些再生和整合转化能力强的感受态细胞才能得到转化植株。至今，以日本结缕草胚性愈伤组织为受体的农杆菌介导法转化体系尚停留在实验室研究阶段。农杆菌介导的外源基因转化是农杆菌菌株与植物细胞之间相互作用的结果，凡是能够影响植物细胞转化应答能力和农杆菌侵染能力及转化子再生能力的各种因素都会对转化效果产生影响。因此，农杆菌转化效率的提高依赖于对各种影响因子的优化和转化条件的改善(易自力，2001)。
技术实现思路
本专利技术的目的克服现有农杆菌介导技术难以应用于禾本科植物遗传转化的缺陷，提供。 为了实现本专利技术目的，本专利技术的，包括步骤1)当根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的菌液OD6tltl值为0. 3-0. 4时，离 心收获菌体，然后向菌体中加入AAM-AS培养基悬浮菌体；2)用悬浮于AAM-AS培养基中的根癌农杆菌侵染日本结缕草的愈伤组织，将侵染后的愈伤组织置于N6D2-AS培养基中共培养2-3天，优选共培养2天，最后洗去根癌农杆菌，筛选并培养愈伤组织；其中，AAM-AS培养基配方为463mg/L (NH4) 2S04+283mg/LKN03+l85mg/LMgSO4 7H20+400mg/L KH2P04+166mg/L CaCl2 2H20+4. 4mg/L MnSO4 4H20+1. 5mg/LZnSO4 *7H20+1. 6mg/LH3B03+0. 8mg/L KI+0. 4mg/L 甘氨酸+0. 02mg/L 维生素 Bl+0. lmg/L 维生素 B6+0. lmg/L 烟酸 +37. 24mg/L Na2-EDTA+27. 84mg/L FeSO4 7H20+100mg/L 肌醇 +900mg/L L-谷氨酰胺+300mg/L L-天冬氨酸+176. 7mg/L L-精氨酸+10mg/L盐酸硫胺+68. 5g/L鹿糖+36g/L葡萄糖+100 u mol/L乙酰丁香酮，pH5. 2 ；N6D2-AS 培养基配方为463mg/L(NH4)2S04+2830mg/LKN03+185mg/L MgSO4 7H20+400mg/L KH2P04+166mg/L CaCl2 2H20+10mg/L MnSO4 4H20+2mg/L ZnSO4 7H20+3mg/L H3B03+0. 75mg/LKI+0. 25mg/L Na2MoO4 2H20+0. 025mg/LCuSO4 5H20+0. 025mg/LCoCl2 6H20+37. 24mg/L Na2_EDTA+27. 84mg/L FeSO4 7H20+10mg/L盐酸硫胺素+lmg/L盐酸批卩多素+lmg/L烟酸+100mg/L肌醇+500mg/LL_脯氨酸+300mg/L水解酪蛋白+500mg/L谷氨酰胺+2mg/L 2,4-D+30g/L鹿糖+10g/L葡萄糖+1. 0g/L水解酪蛋白+100 u mol/L乙酰丁香酮+2g/L植物凝胶，pH5. 2。前述的方法，侵染时间为I. 5_2h,优选I. 5h。前述的方法，洗去根癌农杆菌包括步骤1)将共培养的愈伤组织用无菌蒸馏水冲洗3-5次，边洗边振荡，直至清洗后的液体澄清；2)然后将愈伤组织悬浮于含有450-550mg/L头孢霉素和150-250mg/L氨苄青霉素的无菌水中，25-28°C，100-120rpm，l. 5_2h。前述的方法，所述根癌农杆菌为含有目的基因的转化的根癌农杆菌，其出发菌株优选为EHA105。前述的方法，日本结缕草的愈伤组织的制备方法为将日本结缕草种子浸于次氯酸钠溶液中在磁力搅拌器上消毒，将消毒后的种子用无菌水洗3-5次，4°C下浸泡3-4d ;浸泡后的种子再用次氯酸钠溶液消毒15-25min，用无菌水洗3_5次后，吸干种子表面的水分，接种于愈伤组织诱导培养基上，26 -30°本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法，其特征在于，包括步骤：1)当根癌农杆菌(Agrobacterium？tumefaciens)的菌液OD600值为0.3？0.4时，离心收获菌体，然后向菌体中加入pH值为5.2的AAM？AS培养基悬浮菌体；2)用悬浮于AAM？AS培养基中的根癌农杆菌侵染日本结缕草的愈伤组织，将侵染后的愈伤组织置于pH值为5.2的N6D2？AS培养基中共培养2？3天，最后洗去根癌农杆菌，筛选并培养愈伤组织。

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法，其特征在于，包括步骤 1)当根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的菌液OD6tltl值为0. 3-0. 4时,离心收获菌体，然后向菌体中加入PH值为5. 2的AAM-AS培养基悬浮菌体； 2)用悬浮于AAM-AS培养基中的根癌农杆菌侵染日本结缕草的愈伤组织，将侵染后的愈伤组织置于PH值为5. 2的N6D2-AS培养基中共培养2-3天，最后洗去根癌农杆菌，筛选并培养愈伤组织。2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，侵染时间为I.5-2h。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，侵染时间为I.5h。4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，共培养时间为2天。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，洗去根癌农杆菌包括步骤 1)将共培养的愈伤组织用无菌蒸馏水冲洗3-5次，边洗边振荡，直至清洗后的液体澄清； 2)然后将愈伤组织悬浮于含有450-550mg/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩烈保，代小梅，孙鑫博，王怡杰，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：