用于转化植物的改良的培养基组合物、选择方法和农杆菌菌株技术

本发明专利技术涉及通过农杆菌介导的体细胞胚性愈伤组织或胚性悬浮培养物的转化以及使所转化的细胞再生为结实植物来生产转基因植物的领域。具体地，本发明专利技术涉及产生大戟科(Euphorbiaceae)转基因植物。本发明专利技术还涉及培养基组合物、选择方法和改造的根癌农杆菌(Agrobacterium?tumefaciens)菌株，其改善了农杆菌介导的转化效率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于转化植物的改良的培养基组合物、选择方法和农杆菌菌株专利技术背景本专利技术涉及通过农杆菌介导的体细胞胚性愈伤组织或胚性悬浮培养物的转化以及使所转化的细胞再生为结实植物来生产转基因植物的领域。具体地，本专利技术涉及产生大戟科(Euphorbiaceae)转基因植物。本专利技术还涉及培养基组合物、选择方法和改造的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株，其改善了农杆菌介导的转化效率。用于说明本专利技术的背景或提供关于实践的额外细节的出版物和其它材料通过引用并入本文，并且为了方便分别在参考文献中分组。 全世界正面临着日益减少的化石燃料供应和日益加剧的温室效应。对可再生能源的生产和消费的提高存在着迫切的需求。在寻找替代来源以满足他们的能源安全需要并同时帮助减少引起温室效应的二氧化碳排放时，生物燃料已被许多国家公认为是国家优先考虑的事情。对生物燃料的需求已经对食物生产造成了增加的压力。例如，为了满足德国政府授权的德国对生物燃料的需求，在2017年这个国家的全部耕地将不得不用于种植生物能源作物而没有留下土地用于食物生产。为了缓解这种对土地的竞争并且满足我们对可再生燃料的需求，对利用贫瘠土地生产生物能源存在强烈的需求。大戟科包括有价值的树种，例如橡胶树(Hevea brasiIiensis)和麻风树(Jatropha curcas)和蓖麻(Ricinus communis)。若干麻风树独有的特性使其成为用于生产生物柴油的理想植物。这些特性包括生长于贫瘠土地的能力；对水的需求低；非食品作物状态；与棕榈相比(超过3. 5年)，在种植后0. 5-2年可快速产油。因此，印度尼西亚政府已宣布他们决定在未来五年内将提供约300万公顷土地用于种植麻风树。许多其它亚洲国家正在采用同样大胆的计划。在不同国家中，印度在建立麻风树种植园方面是最先进的。然而，印度麻风树种植园的种子产量低，范围为0. 4-12公吨/公顷(与棕榈果实约19公吨/公顷相比)。同样，报告的核油(kernel oil)含量差异很大，从40. 4-85. 3%(Sun, ff. B.，国际麻风树大会，2008，新加坡)。蓖麻油是润滑剂的重要来源并且还是未来生物柴油潜在的来源。这种差异至少部分归因于对麻风树育种和农场管理缺乏研究。基因工程被认为是作物改良的快速方法。植物转化基本上为两个步骤的过程，即将基因传递入宿主细胞，随后将转化的细胞再生成为植物。体细胞胚性愈伤组织或体细胞胚性悬浮培养物通常被认为是最有效的再生方法，由于大多数转化的细胞已获得成胚潜力，其将很自发地驱使它们发育成体细胞胚。已经公开了用于起始麻风树体细胞胚和维持胚性悬浮培养物的有效方法(国际专利申请号PCT/SG2009/000015 ;美国临时专利61/025, 430)。植物转化方法可宽泛地分类为2组DNA直接转移(例如电穿孔和颗粒轰击)和农杆菌介导的转化。至今，后者已成为转化许多植物所选择的方法。事实上，大多数可商购的转基因棉花和油菜品种源自此方法(Cerdeira和Duke, 2006 ;Dunwell, 2000)。之前在玉米(Dunwel1,1999 ；Vega 等人,2008 ；ffang 和 Frame, 2009)、稻(Christou, 1997 ；Hayashimoto等人，1990 ；Lee 等人，1991 ；Zhang 等人，1997)和大豆(Christou 等人，1988 ；Christou 等人，1987 ;01hoft等人，2003)中的工作显示了将外来DNA引入作物植物的不同方法的实例。转基因植物可在农杆菌介导的转化后获得。这种方法特征在于低频率的转基因产生和形成嵌合体(Gould等人，1991)。转基因植物还可在农杆菌介导的未成熟胚的转化后获得。由于未成熟胚的愈伤组织诱导和植物再生频率通常很高，至今未成熟胚一直是最优选的外植体。转化后，不论DNA传递的方法如何，未成熟胚非常难于再生出可育的植物(Cheng等人，1991)。。另外，在整年内获得未成熟胚通常很困难，并且它们适合于培养的阶段还严格依赖于时间，因此限制了其应用。尽管用未成熟胚转化的频率范围为约0. 14%至约4. 3%，收回的转基因的数目仍是转化胚数目的一小部分。体细胞胚适合于通过根癌农杆菌和颗粒轰击转化。体细胞胚性愈伤组织可以方便地作为液体培养物维持并且快速扩增以生产克隆群体。因此，一旦建立了优良品种的体细胞胚性培养物，将为开发出聚合有转基因性状的遗传学纯系节省多年的时间。许多不同的外植体可以与携带有T-DNA载体的农杆菌菌株共培养来产生转基因细胞，所述转基因细胞可以通过体细胞胚发生或器官发生途径再生成正常植物。对麻风树 再生和转化的研究一直非常有限。Jha等人(2007)报告了使用叶组织产生麻风树体细胞胚。Li等人(2008)报告了将叶盘与农杆菌共培养转化麻风树并通过器官发生途径再生。然而，在麻风树研究领域中两种方法都是不容易重复的(Z. Mao等人，Temasek Life Science Laboratories,新加坡，私人通信；A. Suwanto, Bogor Agricultural University,印度尼西亚；私人通信)。Mao等人(美国临时专利申请号61/122，454)公开了通过农杆菌介导的叶外植体转化和通过体细胞胚发生途径再生来产生转基因麻风树植物。该专利技术还使用嫁接技术克服转基因小植株生根困难。国际公开号WO 2008/012832公开了体外繁殖麻风树的有效方法，其通过叶盘直接再生，没有任何中间愈伤组织阶段。没有报告过基于此再生方法的遗传转化。因此，仍有待开发用于转化麻风树的可靠和高效的方法。尤其欢迎将导致更短的再生时间、更高的转化率和高通量转化工作的改良。T-DNA通过农杆菌细胞向植物宿主细胞的传递依赖于毒力基因的预诱导。已知在受伤的植物组织中天然产生的诱导剂包括多种酚类化合物，例如乙酰丁香酮、芥子酸(3，5- 二甲基氧-4-羟基肉桂酸)、丁香酸(4-羟基-3，5- 二甲基氧基苯甲酸)、阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)、儿茶酚(1，2_邻苯二酚)、对羟基苯甲酸(4-羟基苯甲酸)、￠-雷琐酸(2，4-二羟基苯甲酸)、原儿茶酸(3，4-二羟基苯甲酸)、焦性没食子酸(2，3，4-三羟基苯甲酸)、没食子酸(3，4，5-三羟基苯甲酸)和香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)(美国专利号6，483，013)。已发现组成型表达的VirG突变蛋白质(virGN54D)可提高农杆菌毒力和转化效率(Hansen等人，1994)。同样，添加毒力诱导剂，例如乙酰丁香酮或胭脂碱，提高了在固体培养基上繁殖的棉花茎尖(Veluthambi等人，1999)和体细胞胚性愈伤组织(美国专利号6，483，013)的转化效率。乙酰丁香酮是大量不能分泌农杆菌毒力诱导化合物的真菌转化所必不可少的(Bundock 等人，1995 ；de Groot 等人，1998)。美国专利号6，162，965和6，310，273公开了根癌农杆菌在与植物细胞，尤其是禾本科植物共培养期间会诱导细胞坏死。抑制坏死的化合物，例如，2，5-降冰片二烯、降冰片烯、硫代硫酸银、氨基乙氧基乙烯基甘氨酸、钴盐、乙酰水杨酸或水本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于转化大戟科(Euphorbiaceae)植物的方法,其包括步骤 a)建立和维持胚性愈伤组织细胞； b)将所述细胞与携带含有感兴趣的多核苷酸的感兴趣的T-DNA载体的农杆菌培养物在共培养培养基中共培养以生产转化的细胞，所述转化的细胞具有稳定地整合入它们基因组的感兴趣的多核苷酸； c)在选择培养基上选择所述转化的细胞； d)在发育培养基上使所选择的转化的细胞发育成转基因体细胞胚； e)在成熟培养基上使转基因体细胞胚成熟； f)在萌发培养基上使所述体细胞胚萌发成小植株；和 g)将所述小植株转移入土壤以进一步发育成开花植物。2.权利要求I的方法，其中所述胚性愈伤组织细胞源自体细胞胚或合子胚。3.权利要求2的方法，其中在固体培养基上或液体培养基中培养所述胚性愈伤组织细胞。4.权利要求3的方法，其中所述培养基包括不含NH4NO3的MS盐、MS维生素、碳水化合物源、聚乙二醇(PEG)，生长素、谷氨酰胺和天冬酰胺。5.权利要求4的方法，其中所述碳水化合物源的量为约10g/l至约30g/l，PEG的量为约10g/l至约80g/l，生长素是量为约O. OImg/1至约2mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，谷氨酰胺的量为约O. lg/Ι至约lg/Ι，天冬酰胺的量为约O. lg/Ι至约lg/1。6.权利要求5的方法，其中所述碳水化合物源为蔗糖而PEG为PEG8000。7.权利要求I的方法，其中所述共培养培养基包含农杆菌MinAB盐并优选包含维生素，优选维生素B5。8.权利要求7的方法，其中所述共培养培养基还包含毒力诱导剂，例如乙酰丁香酮，优选的量为约5 μ M至约200 μ Μ，并且任选地含有支持农杆菌正常生长的化合物，例如组氨酸。9.权利要求I的方法，其中所述农杆菌选自以下一或多种组成的组 (a)预诱导的农杆菌， (b)超毒力农杆菌菌株，优选农杆菌菌株AGLl和其衍生物， (c)农杆菌菌株，其含有不需要化学物质诱导毒力的突变的virA基因，优选农杆菌菌株AGL2 (ATCC专利保藏名称PTA-10447)，和 (d)营养缺陷型农杆菌菌株，优选对谷氨酰胺和天冬酰胺不是营养缺陷，优选农杆菌菌株AGL3 (ATCC专利保藏名称PTA-10448)。10.权利要求I的方法，其中在多孔支持物例如膜或滤纸上或在固体培养基上进行共培养。11.权利要求I的方法，其中在固体培养基上进行选择，优选通过将共培养细胞包埋入固体培养基进行选择。12.权利要求I的方法，其中所述选择培养基包含GamborgB5矿物盐、维生素B5、选择齐U、抑制农杆菌生长的化合物例如头孢噻肟、量为约10g/l至约30g/l的碳水化合物源和量为约O. Img/1至约10mg/l,优选约2mg/l的生长素。13.权利要求12的方法，其中所述碳水化合物源为蔗糖而所述生长素为2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。14.权利要求11的方法，其中所述固体培养基含有植物凝胶并且包埋培养基含有低熔点琼脂糖。15.权利要求9的方法，其中所述农杆菌菌株为营养缺陷型农杆菌菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·蔡，L·孙，L·付，L·季，
申请(专利权)人：淡马锡生命科学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：