通过重组酵母口服/粘膜接种疫苗的方法技术

本发明专利技术涉及重组酵母细胞的产生，所述重组酵母细胞被用于接种以及疫苗特别是通过服食而口服接种疫苗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对传染病的防范在人类医学以及兽医学中依然是巨大的挑战。对于病毒感染而言情况尤其复杂，与细菌感染相反，其通常不能用广谱的有效物质来控制且会引起巨大的经济损失。针对病毒性疾病的新的有效接种疫苗策略的开发因而具有突出的重要意义。传统上针对病毒性疾病的预防性以及治疗性接种疫苗是经“减毒的”，即利用通过诱变改造的具有显著降低或者缺失的毒力的病毒(“活疫苗”)、或灭活的病毒(“死疫苗”)。近来，也建立了日益增加的所谓“亚单位疫苗”或者“标记疫苗”，其中使用给定的经遗传工程改造的病原体“主要抗原(Hauptantigen) ”。术语“标记疫苗”意指通过随后的诊断分析可清楚地将经接种疫苗的个体与自然感染的个体区别开。对于主要抗原可理解为例如病毒包膜或病毒衣壳的蛋白，其在缺乏完整的病毒颗粒时可在宿主中诱导体液和/或细胞免疫应答，作为其结果病毒感染可被阻断或者被控制。“亚单位接种疫苗”需要先将主要抗原进行表征。这些蛋白的生产(表达)及免疫原性配制对于接种疫苗的过程发挥着关键的作用，特别是病毒的外壳蛋白大多数不溶于水并且在细菌表达系统中仅有很少的能被重组表达。以纯化的形式获得“亚单位”疫苗并确保其持久性的方法相应地成本较高。 酵母作为用于重组蛋白的表达系统将细菌系统经济的优点与高等细胞典型的组织形式结合起来。它们通过细胞内膜系统来区室化(kompartimentiert),这从根本上将其与细菌宿主系统区别开并且使得膜锚定的病毒外壳蛋白或者甚至是整个病毒衣壳能够表达。此外，构成酵母细胞壁的3 -葡聚糖、葡萄糖聚合物具有长久以来已知的免疫刺激效应。由此，任务是开发一种方法，其中完整的酵母可被用于接种疫苗。此问题由如下方式解决，通过基因工程的方法将免疫原决定簇(immunogene Determinanten)的基因引入非病原酵母的基因组并表达，并将此重组酵母细胞直接用于接种疫苗以及特别是通过服食而口服接种疫苗。乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)乳酸克鲁维氏酵母属于具有GRAS (通常认为安全)级别的所谓的食品级酵母。与作为食品添加剂经过了上千年测试和验证的面包酵母一样，在奶制品中通常的代表性酵母乳酸克鲁维氏酵母对于食品工业也是安全无害的。口服/粘膜接种疫苗对于疫苗/抗原的施用有如下的方式可选择皮下、肌内、肠胃外、或粘膜/ 口服。而在前三种方式中抗原直接进入血液或淋巴管道，对于粘膜/ 口服应用抗原的暴露则是通过支气管或胃肠道粘液膜(粘膜)进行的。因而术语粘膜/ 口服包括抗体的鼻/支气管施用以及口服施用。支气管和肠粘膜均持久地暴露于病原体并且其本身是感染的主要接受屏障。与粘膜表面特别是粘膜肠上皮结合的免疫系统包含了例如人体内所有免疫活性细胞的约90%。在肠粘膜中所谓的诱导位点，抗原的接受和呈递通过树突细胞和“淋巴集结”的M-细胞(总体上称为MALT，粘膜相关性淋巴样组织)而进行，但根据近来的发现也通过肠细胞和肠上皮细胞进行。在鼻/支气管粘膜上存在类似的组合(BALT，支气管相关性淋巴样组织)。在免疫应答缓和(Abklingen)后，在整个生物体以及在粘膜特异性记忆免疫细胞的所谓效应位点通常产生针对原始抗原/病原体介导的长效防护。口服/粘膜接种疫苗方法的优势。与肠胃外免疫相比，口服/粘膜免疫需要使用显著较高的量的抗原。与肠胃外接种介苗相反，通过口服/粘膜接种疫苗可以在诱导全身免疫应答之外还在粘膜的效应位点诱导局部免疫应答。特别是对于(也)通过粘液膜传播的病原体(如牛病毒性腹泻病毒BVDV和猪瘟病毒CSFV，见下文)而言，粘膜/ 口服接种疫苗具有产生有活性且长效免疫的潜力。口服/粘膜接种疫苗的重要优势还有良好的接受性和经济性。在最理想的情况下所述疫苗可以低成本生产并方便地与食物一起施用。用表达病毒抗原的酵母菌株进行的粘膜/ 口服接种疫苗不仅仅安全无害，还能够具有额外的健康增强和辅佐效应。现在的目标是开发出基于乳酸克鲁维氏酵母的表达系统，其允许外源基因定向整合到酵母基因组中并因此使得能够形成适当的抗原。进一步的目标是表达特定病毒抗原的重组乳酸克鲁维氏酵母菌株，其用于接种疫苗以及特别是用于粘膜/ 口服接种疫苗。根据本专利技术，通过遗传工程的方法产生乳酸克鲁维氏酵母的菌株(优选、VAK367-D4及其变体)，其允许外源基因定向整合至酵母基因组的LAC4基因座而不必引入额外的DNA序列(选择性标记或其它的)。该重组酵母菌株稳定无选择压力并且在发酵的条件下能够被培养至高密度。外源基因的表达可以通过乳糖或半乳糖的剂量来诱导，或者在关闭调节基因KIGAL80后组成性地激活。外源基因的表达可间接地通过内源报道基因的表达而进行定量。产生了在乳酸克鲁维氏酵母菌株VAK367-D4上构建的一系列变体。通常这些变体可诱导地表达大量的蛋白、或该蛋白的结构域、或与不同种(artfremd)蛋白结构域融合的该蛋白的结构域。所关联的不同种蛋白结构域用于进行免疫应答的定向刺激(辅佐目的)或者用于所表达的外源蛋白在酵母细胞内的定向区室化(Kompartimentierung)。在辅佐效应之外，所表达的外源蛋白的区室化对于表达的优化或者表达产物的形成很重要。这些重组乳酸克鲁维氏酵母菌株之一(参见实施方案)已成功地被用于粘膜/口服接种疫苗。实施方案I.乳酸克鲁维氏酵母菌株VAK367_D4(Mefura3 lac4: : ScURA3)的产生。用于异源表达外源蛋白的起始菌株VAK367具有如下特性其允许培养物达到高细胞密度而不伴有细胞内蛋白可检测的释放。在这点上此菌株与许多紧密关联的乳酸克鲁维氏酵母菌株不同。菌株VAK367通过两轮的诱变而衍生自菌株CBS 2359 (Centraalbureauvoor Schimmelcultures http: //www. funRalbiodiversitycentre. com),并且是氨基酸甲硫氨酸和核碱基尿嘧啶的营养缺陷型。可通过遗传工程的方法从菌株VAK367衍生出菌株 VAK367-D4 (保藏于 Braunschweig 的 Deutschen Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ))，其中借助质粒pD4_2经ScURA3基因而取代LAC4基因从+358至+1181的序列。该菌株VAK367-D4允许外源基因整合至LAC4基因座而无附加的标记，其要在乳糖上生长来筛选。这需要使用适当的整合载体如Klp3 (见下文)，通过同源重组取代分裂盒(Disruptionskassette),从而在失去ScURA3标记时重组完整的LAC4基因(图I)。2.允许外源蛋白可诱导地表达的整合载体的产生。载体K1d3载体Klp3是一种基于YRp7的大肠杆菌(E. coli)载体，由于ARSl序列被缺失,其在酵母中不能自主复制。Klp3含有使LAC4基因座能够通过同源重组进行整合的乳酸克鲁维氏酵母序列(LAC4的上游区域和LAC4阅读框的5’端)。在LAC4启动子和转录起点之间插入一个DNA区段，其含有TEFl终止子和KIGAL80启动子。由此LAC4阅读框受到KIGAL80启动子的控制，该启动子通过转录因子KIGal4与LAC4启动子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·布罗伊尼希，SE·贝伦斯，
申请(专利权)人：哈雷维滕贝格马丁路德大学，
类型：发明
国别省市：