本发明专利技术发现耐辐射异球菌Deinococcus?radiodurans?R1中的trkB基因（DR1667）具有增强原核生物及植物的抗逆能力。本发明专利技术构建了包含上述基因的重组载体，把它们分别导入原核及真核宿主细胞。实验证明，trkB基因（DR1667）在原核宿主细胞和油菜中表达后，均能增强其耐盐抗性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及耐福射异常球菌Rl (Deinococcus radiodurans Rl) trkB基因(DR1667，GeneID: 1799538)的新功能，具体涉及该基因在增强植物对盐胁迫抗性方面的应用。
技术介绍
盐碱对农作物造成的损失在所有非生物胁迫中占首位(Dracup et al.，1998)。耐辐射异常球菌Rl (D. radiodurans Rl)因对长期的干燥和强氧化胁迫具有极强的抗性，而成为研究微生物非生物胁迫适应机制的理想菌株。 HKT (high-affinity K+transporter)基因家族转运蛋白具有可以调节植物体内K+/Na+平衡的能力，广泛存在于植物、真菌、真细菌和古细菌中。耐辐射异常球菌Rl(D. radiodurans Rl)含有2个HKT类蛋白，与植物Na+转运关系密切密切相关，对长期的干燥和强氧化胁迫具有极强的抗性。钾是植物体必需的营养元素之一，钠是植物生长的功能元素，对于大多数植物而言，少量有益，过量则会产生毒害。植物对它们的吸收主要靠其体内的通道蛋白和转运载体。植物HKT转运蛋白与真菌Trk转运蛋白、原核生物的KtrB和TrkH的K转运蛋白的联系紧密，真菌中Trk转运蛋白是低K浓度下主要的K吸收系统。大多数植物中都可能存在HKT转运蛋白，这个基因家族并不是很大，在拟南芥中该家族只有一个成员。序列分析推测，这个家族的转运蛋白可能由细菌的2次跨膜结构的K通道进化而来，形成现在的8次跨膜和4个圈的一孔结构蛋白。HKT家族基因主要分为2个亚家族，亚家族I成员是特异性的Na低亲合转运蛋白，大部分分布于根系中柱的细胞质膜上，尤其是木质部薄壁细胞膜上，负责从木质部汁液中重新获取Na而阻止其向地上部的运输；而亚家族2成员是K/Na高亲合转运蛋白，尤其在K缺乏条件下负责对Na的吸收从而促进作物的生长，主要分布于根系的皮层和内皮层细胞膜上。Deinococcus radiodurans (D. radiodurans)是至今已知生物中最高的福射抗性的生物之一。该菌具有对致死剂量的电离辐射、UV辐射以及DNA损伤试剂的极端抗性，能将电离辐射造成上百个DNA双链断裂的基因组完整恢复如初，且不发生突变的能力。1999年基因研究所(TIGR)完成和公布了 D. radiodurans基因组全序列(White 1999)。尽管耐辐射菌株与干旱胁迫抗性在进化上可能具有协同性，但目前未见耐福射异球菌Deinococcusradiodurans Rl中的trkB基因(DR1667，GeneID: 1799538)在增强植物耐盐性方面的功能的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是从D. radiodurans Rl基因组中发现能够增强植物对高盐的抗性基因。并将该基因转入植物，使转入该基因的植物获得耐盐的能力。本专利技术通过如下研究发现，首次发现，SEQ ID NO: I所示序列的Deinococcusradiodurans Rl的trkB基因(DR1667，GeneID: 1799538)具有抗盐胁迫的功能，可用于培育耐盐性状的植物I、获得含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)的重组工程菌株I)通过 PCR 从 D. radiodurans Rl (DSM 20539)菌株基因组扩增出 D. radioduransRltrkB基因(DR1667)，基因序列号为GeneID :1799538。其大小为1377bp，该基因编码456个氨基酸，将其克隆于载体pGEMT-easy上，构建了含有完整trkB基因的重组质粒pGEMT-trkB ；2)将trkB基因(DR1667)连接于pRADZ3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌和耐辐射异球菌中都起作用的groEL启动子，构建含有groEL启动子的完整trkB基因(DR1667)重组质粒 pRADZ3-trkB G ；3)将导入trkB基因(DR1667)的重组质粒pRADZ3-trkB G转入受体大肠杆菌JM109 中，获得工程菌株JM-trkB (详见实施例I)；2、含有D. radiodurans Rl trkB基因工程菌株的耐盐实验实验证实，经4M NaCl 冲击后，含有 D. radiodurans Rl trkB 基因(DR1667)的JM-trkB重组菌株生长状况良好，菌落数高于只含空质粒的JM-Z3菌株(见实施例2及图4)。该工程菌株具有耐受4M NaCl冲击的能力。此实验表明D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)具有增强原核生物耐盐的能力。3、trkB基因(DR1667)在油菜中表达及转基因植株的耐盐抗性鉴定I)将D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)连接到植物表达载体pBI121中，构建具有trkB基因(DR1667)的重组质粒pBI121_trkB ；2)将pBI121-trkB重组质粒转化油菜中，获得了能够耐盐的转基因油菜植株；此实验表明D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)具有培育耐盐植物的用途(见实施例3及图5 6)。附图说明图I是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)序列的PCR产物验证电泳图-i'Tfe1曰；图2是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)及groEL启动子的原核表达载体的构建验证电泳图谱；图3是在高浓度盐(4M NaCl)冲击前的含有空载体和含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)序列的原核表达载体的大肠杆菌的生长状况的菌落照片，其中a是含有空表达载体的大肠杆菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)表达载体的大肠杆菌重组菌株；图4是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)的原核表达载体及空载体的大肠杆菌(E. coli)在含4M NaCl培养基中的生长情况的菌落照片，图中的菌株如下a是含有空表达载体的大肠杆菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)表达载体的大肠杆菌重组菌株。图5是在250mmol NaCl的培养基上培养15天后非转基因油菜，已萎蔫；图6是在250mmol NaCl的培养基上培养15天后转基因油菜，转基因油菜能在含250mmol的NaCl的胁迫下正常生长。具体实施例方式以下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本专利技术作进一步详细说明，并不对本专利技术的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下克隆载体pGEMT-easy :为Promrga公司市售产品；穿梭质粒pRADZ3 :为本实验室保存； 植物表达载体pBI121 :为Clontech公司市售产品；大肠杆菌JM 109 :为北京全式金公司市售产品。根癌农杆菌EH本文档来自技高网...
【技术保护点】
SEQ？ID？NO:1所示序列的基因培育耐盐植物的用途。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林敏，王劲，左开井，陈明，张维，平淑珍，陆伟，燕永亮，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。