本发明专利技术属于家畜基因工程技术领域，公开了一种获得山羊MEF2C基因三种转录剪切体的方法。首先从南江黄羊肌肉组织中分离出核糖核酸；设计特定的引物，利用PCR扩增出cDNA片段。经过克隆和测序分析证实了在山羊MEF2C基因转录过程中存在3种剪切形式，包含外显子的缺失。这一发现为研究山羊MEF2C基因的表达及功能究奠定了重要基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于家畜基因工程
，具体涉及一种获得山羊MEF2C基因新转录剪切体的方法。
技术介绍
MEF2C基因（Myocyte Enhancer Factor 2C）参与调控细胞增殖和肌肉分化的重要调节因子，属于转录调节因子MADS-Box家族成员之一（该家族成员还包括:MCMI、AGAMOUS、DEFICIENS和SRF）。MEF2C基因是MEF2基因家族中，在骨骼肌中表达最早的基因，在细胞分化过程必不可少，控制着肌细胞分化过程中的基因转录。MEF2转录因子的结构主要分为N端和C端，其N端在不同物种中几乎相同，都含有一个MADS-box结构域和与其直接相邻的MEF2结构域。MADS-box是含有57个氨基酸的DNA结合区域，具有高度保守性，拥有一些不变的残基，能与富含A/TDNA序列结合，并介导MADS-box因子的二聚化；MEF2结构域由MADS-box临近的29个氨基酸组成，是MEF2因子所特有的结构域，其主要功能是有助于提高DNA结合的亲和力和蛋白质的二聚化，同时也为MEF2与其它辅因子间相互作用提供场所。MEF2的C末端是一个转录活性区，含有磷酸化位点，是多种激酶的靶点，与启动基因表达有关，是其活性调节及发挥功能的主要区域，由Pre-mRNA选择性拼接形成不同的剪接体。由于该转录活性区域由选择性拼接产生，因此，无论从它的基因结构或其蛋白质的形式都决定了MEF2C功能上的复杂性。目前，NCBI记载的人MEF2C剪接体有6种，在猪发现2种剪接体，鸭2种剪接体。目前在山羊上还未见有关MEF2C基因不同转录剪切体的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供山羊MEF2C基因的新转录剪切体、其扩增引物及扩增方法。本专利技术所述的山羊MEF2C基因，有三种转录剪切体MEF2C-AS1，MEF2C-AS2和MEF2C-AS3，其核苷酸序列分别如SED ID NO.1，SED ID NO.2和SED ID NO.3所示。本专利技术提供了用于扩增山羊MEF2C基因的一组扩增引物：正向引物MEF2C-F的核苷酸序列如SED ID NO.4所示；反向引物MEF2C-R的核苷酸序列如SED ID NO.5所示。本专利技术还提供了一种扩增山羊MEF2C基因，包括三种转录剪切体MEF2C-AS1，MEF2C-AS2和MEF2C-AS3的方法，步骤如下：步骤1：提取山羊肌肉组织的总RNA；步骤2：从近缘物种人，小鼠，牛和绵羊MEF2C基因序列中分析保守序列，以此作为参考来设计所述引物；步骤3：以步骤1所得总RNA为模板，PCR扩增获得山羊MEF2C基因的片段。对所得序列用NCBI网站进行blastn在线分析，与MEF2C序列一致性最高的序列都是MEF2C在哺乳动物中的同源序列，可以确定所得序列为山羊MEF2C基因。利用Clustalx V2.0软件对山羊MEF2C基因（包括三种转录剪切体MEF2C-AS1，MEF2C-AS2和MEF2C-AS3）的核苷酸序列进行比对分析并使用MEGA5.2软件构建NJ树。本专利技术以山羊肌肉组织为材料，利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），对山羊MEF2C基因进行了研究，首次从山羊肌肉组织中克隆得到了MEF2C基因三种转录剪切体（MEF2C-AS1，MEF2C-AS2和MEF2C-AS3），并对其同源性和进化地位进行了分析，对研究山羊MEF2C基因不同转录剪切体在肌肉生长发育过程中发挥的生物学功能具有重要意义。附图说明序列表SEQ ID NO：1是本专利技术克隆的山羊MEF2C基因的转录剪切体1序列片段。序列表SEQ ID NO：2是本专利技术克隆的山羊MEF2C基因的转录剪切体2序列片段。序列表SEQ ID NO：3是本专利技术克隆的山羊MEF2C基因的转录剪切体3序列片段。图1：山羊MEF2C基因不同转录剪切体PCR产物电泳检测图。图2：山羊MEF2C基因不同转录剪切的示意图。图3：近缘哺乳动物MEF2C基因编码区序列的NJ系统进化树。 具体实施方案以下结合附图，通过实施例对本专利技术进一步详细说明。本专利技术中山羊采自四川省南江黄羊育种场，RNA提取纯化等试剂购自Invitrogen公司，PCR试剂购自宝生物（大连）有限公司（Takara）。总RNA提取：取100mg山羊肌肉组织在研钵中加液氮研磨，用Trizol法提取总RNA，Trizol试剂购自Invitrogen公司，提取方法根据使用说明书。山羊MEF2C基因序列的克隆，包括三个转录剪切体MEF2C-AS1，MEF2C-AS2和MEF2C-AS3：通过比对已公开的近缘哺乳动物（人、小鼠、牛和绵羊）的MEF2C基因序列得到保守区，在保守区序列设计引物扩增山羊MEF2C基因。山羊MEF2C基因的克隆：使用正向外引物MEF2C-F与反向外引物MEF2C-R进行PCR扩增，获得山羊MEF2C基因的目的片段； MEF2C-F：5'-TTACGAGGATTATGGATGAACG-3' MEF2C-R：5'-GGGGTGGTGGTACGGTCT-3'扩增反应体系如下： PCR反应条件为：95 ℃，5min，94 ℃ 45s，61 ℃ 30s，72 ℃ 90s，35个循环；72 ℃ 10min；4 ℃保存。将PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将两条条带清晰明亮、大小不一的片段进行切胶回收（图1）。胶回收纯化使用天根生化科技（北京）有限公司试剂盒（DP214-02），操作步骤按产品说明书进行。纯化后PCR产物与宝生物公司的pMD-19T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选单克隆扩增培养，经PCR扩增电泳检测后送上海生工公司测序。将测序结果在NCBI上运用blastn在线比对软件以验证序列的正确性和该方法的可靠性。结果表明该方法扩增获得三条片段，所得的三条片段均为山羊MEF2C基因序列，是三种不同转录剪切体MEF2C-AS1，MEF2C-AS2和MEF2C-AS3（SEQ ID NO：1-3），其中MEF2C-AS1完全缺失第四外显子序列；MEF2C-AS2完全缺失第三外显子序列；MEF2C-AS3完全缺失第三和第四外显子序列（图2）。对已公布的人、小鼠、牛、绵羊和猪的MEF2C基因编码区序列进行Clustalx V2.0比对，然后导入MEGA5.2软件构建Neighbor-Joining（NJ）系统进化树。系统进化树反映出新发现的山羊MEF2C剪接体聚类到一起，然后分别与绵羊、牛、猪的MEF2C基因聚类。而与人和小鼠的遗传距离较远（图3）。应当说明的是，对本专业内的普通研究人员来说，可以依据上述方法适当改进及修改，但所有的改进和修改都应属于本专利技术所附权利要求的保护范围。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
作为山羊MEF2C基因的转录剪切体，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述。
【技术特征摘要】
1.作为山羊MEF2C基因的转录剪切体，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述。
2.根据权利要求1所述的基因片段，其特征在于：其中SEQ ID NO：1片段完全缺失第四外显子序列；；SEQ ID NO：2片段完全缺失第三外显子序列；SEQ ID NO：3完全缺失第三和第四外显子序列。
3.检测权利要求1所述遗传标记的正、反向引物的DNA序列如下所示：
MEF2C-F：5'- TTACGAGGAT...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈并兵，占思远，李利，张红平，王林杰，仲涛，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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