本发明专利技术公开了一种过表达RimL的大肠杆菌及其在制备N-乙酰化胸腺素α中的应用。本发明专利技术提供了一种重组菌，为将RimL的编码基因和胸腺素α的编码基因导入宿主菌中得到的重组菌。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术构建了N-乙酰基转移酶RimL和胸腺素α的编码基因进行共表达得到的重组菌，发酵该重组菌，得到胸腺素α均大多为N-乙酰化胸腺素α，具有明显的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种过表达RimL的大肠杆菌及其在制备 N-乙酰化胸腺素α中的应用。
技术介绍
蛋白和多肽的N-末端乙酰化修饰是真核细胞中普遍存在的一种修饰，50%以上的真核细胞胞浆蛋白都有这种修饰。初步的功能研究表明N-末端乙酰化可通过改变N-端的电荷性，封闭N端等方式，对许多蛋白和多肽的空间结构、配体识别、抗降解等特性产生重要影响。如小分子GIPaes-Arl3P蛋白的N-末端乙酰化修饰促进了其与膜受体Syslp/ hSysl的识别，并使其定位到膜上。胎儿血红蛋白的N-末端乙酰化可以使其四聚体的解聚能力提高30倍。胸腺素α 1 (thymosin α 1，T α 1)的Ν_末端乙酰化对其在血浆中的稳定性具有重要作用。除了 Τα 1外，还有如黑色素细胞刺激素(Melanocyte-Mimulating Hormones, a -MSH)、胸腺素β 4 (Thymosin β 4，T β 4)等一批在临床上具有重要应用的多肽也需要N-末端乙酰化修饰。与真核生物中的普遍存在现象明显不同的是，原核生物的N-末端乙酰化修饰非常罕见。在大肠杆菌内源蛋白中已知发生N-末端乙酰化修饰的只有核糖体亚基L7、S5、 S18、延长因子EF-Tu和伴侣蛋白kcB等为数不多的几种蛋白。大肠杆菌中已经发现的参与蛋白和多肽的N-末端乙酰化修饰的乙酰基转移酶只有负责核糖体亚基S5乙酰化修饰的 RimI，核糖体亚基S18乙酰化修饰的RimJ，和核糖体亚基L7乙酰化修饰的RimL。这些乙酰基转移酶有很强的底物专一性。除上述每个酶对应的特异性底物外，未知其能修饰大肠杆菌的其它蛋白或多肽。胸腺素α是一族具有相同或相似的N-端序列的免疫调节多肽，它们包括胸腺素 α原、胸腺素a 1、胸腺素a 11及其各种融合蛋白等。胸腺素a 1和胸腺素a 11是胸腺素 α原在体内降解的产物，它们分别包括了胸腺素α原的化端观和35个氨基酸。不同物种的胸腺素α具有很高的保守性。胸腺素α的氨基酸序列上某些位点存在多态性，如其 N-端第13位氨基酸残基，有的是苏氨酸，有的是异亮氨酸，它们具有相同或相似的功能。胸腺肽是一类动物胸腺中提取的包含各种胸腺素α及其它胸腺来源肽类的免疫制剂，已广泛用于病毒性肝炎、肿瘤等的治疗。但动物提取的胸腺肽存在成分复杂，纯度低， 其中混有动物来源的污染物，易产生过敏反应等问题。化学合成的N-乙酰化胸腺素al， 是一种采用多肽化学合成方法制备的N-乙酰化胸腺素a 1，此种方法获得的T a 1纯度高、 活性高、没有明显的副反应，如kiClone公司的“日达仙”，已被包括我国在内的多个国家批准用于病毒性肝炎的治疗获作为免疫调节药物；但化学合成N-乙酰化胸腺素a 1这样一个观个氨基酸的多肽，合成和纯化工艺复杂，得率较低，因此制品价格高，限制了该药的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种重组菌。本专利技术提供的重组菌，为如下1)或2)1)将RimL的编码基因和胸腺素α的编码基因导入宿主菌中得到的重组菌；所述宿主菌为基因组中含有RimL编码基因的宿主菌；2)将胸腺素α的编码基因导入如下所述的重组菌中得到的重组菌；所述RimL为如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)与a)或b)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述胸腺素α为一种多肽或蛋白，其N末端的观个氨基酸残基与序列表中序列 3的N末端的观个氨基酸相同或其N末端的观个氨基酸残基与序列表中序列3的N末端的28个氨基酸至少具有90%同源性。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。1)所示的重组菌中，所述将RimL的编码基因和胸腺素α的编码基因导入宿主菌的方法包括如下步骤a)将所述RimL的编码基因通过重组载体2导入所述宿主菌，得到重组菌A ；b)将所述胸腺素α的编码基因通过重组载体1导入步骤a)得到的所述重组菌 A，得到重组菌；所述重组载体1为所述胸腺素α编码基因插入表达载体1中，得到表达胸腺素α 的重组载体1 ；所述表达载体1优选为PBV220 ；所述重组载体1具体为将所述胸腺素α编码基因插入PBV220的BamHI和EcoRI酶切位点间，得到表达胸腺素α的重组载体1 ；所述重组菌A为将所述RimL的编码基因通过重组载体2导入宿主菌中，得到的重组菌A ；所述表达载体2优选为pOKBV ；所述重组载体2具体为将所述RimL的编码基因插入 pOKBV载体中的EcoR I和Ml I酶切位点间中，得到表达RimL的重组载体2。1)所示的重组菌中，所述宿主菌为大肠杆菌；所述RimL编码基因是如下1)或2)任一所示的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)与1)限定的DNA序列至少具有90%同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA 分子；所述胸腺素α编码基因为一种多核苷酸，其核苷酸序列与序列表中的序列4的5’ 末端起84位核苷酸相同或者与序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸同源性至少具有90%的DNA分子。本专利技术的另一个目的是提供一种重组菌Α。本专利技术提供的重组菌Α，为将所述RimL的编码基因通过重组载体导入宿主菌中， 得到的重组菌A ；所述重组载体为将所述RimL的编码基因插入表达载体中，得到表达RimL的重组载体，所述表达载体是通过诱导型启动子控制RimL的编码基因表达的。所述诱导型启动子为乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酯酶启动子、色氨酸启动子、噬菌体T7、PL, Pe启动子或含有这些启动子部分元件的杂合启动子Tac、PJV所述表达载体优选为P0KBV。本专利技术的第三个目的是提供一种重组菌。本专利技术提供的重组菌，为将外源诱导型启动子插入宿主菌的乙酰基转移酶编码基因的上游，用于启动所述乙酰基转移酶编码基因的表达，得到的重组菌。所述诱导型启动子为乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酯酶启动子、色氨酸启动子、噬菌体T7、PL, Pe启动子或含有这些启动子部分元件的杂合启动子Tac、PJV所述宿主菌为大肠杆菌；所述的诱导型启动子为噬菌体T7启动子，其核苷酸序列为序列表中序列5的自5’ 末端第1119-1135位核苷酸；所述乙酰基转移酶为RimL，所述RimL为如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)与a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。上述重组菌按照如下方法制备1)将pKD46质粒导入宿主菌中，得到重组菌1 ；2)将含有T7启动子的DNA分子导入步骤1)得到的重组菌1中，得到重组菌2 ；3)将步骤2、得到的重组菌2分别在含氯霉素的培养基和含氨苄青霉素的培养基中培养，若能在含氯霉素的培养基上生长，但不在含氨苄青霉素的培养基生长的即为重组菌；所述含有T7启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列5的1119-1135位核苷酸。所述的本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种重组菌，为如下１）或２）：１）将ＲｉｍＬ的编码基因和胸腺素α的编码基因导入宿主菌中得到的重组菌；所述宿主菌为基因组中含有ＲｉｍＬ编码基因的宿主菌；２）将胸腺素α的编码基因导入如下权利要求６－８中任一所述的重组菌中得到的重组菌；所述ＲｉｍＬ为如下（ａ）、（ｂ）或（ｃ）所示的蛋白：（ａ）由序列表中序列２所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（ｂ）将序列表中序列２所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有相同功能的蛋白；（ｃ）与ａ）或ｂ）限定的ＤＮＡ序列至少具有９０％同源性且具有相同功能的蛋白；所述胸腺素α为一种多肽或蛋白，其Ｎ末端的２８个氨基酸残基与序列表中序列３的Ｎ末端的２８个氨基酸相同或其Ｎ末端的２８个氨基酸残基与序列表中序列３的Ｎ末端的２８个氨基酸至少具有９０％同源性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴军，刘波，巩新，唱韶红，马清钧，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。