一株淡黄色链霉菌突变菌株，构建方法及其用途技术

本发明专利技术公开了淡黄色链霉菌(Streptomyces?flaveolus)的突变菌株、构建方法及其用途。包括基因置换获得的突变菌株或者基因中断获得的突变菌株。基因置换突变菌株保藏编号为CGMCC?4948，该突变菌株的构建是通过对淡黄色链霉菌敲除部份氨莎三烯生物合成基因实现的。本发明专利技术的突变菌株，可以用于萨菲菌素Sanglifehrin?A的发酵生产，而不产氨莎三烯类杂质，方便萨菲菌素的分离纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物基因资源和基因工程领域，具体地说是一株淡黄色链霉菌突变菌株，构建方法及其用途，利用基因敲除手段获得了一株不产氨莎三烯类杂质的淡黄色链霉菌突变菌株CGMCC 4948，以及其应用于萨菲菌素的发酵。 萨菲菌素(Sanglifehrin A，缩写成SFA，结构式如下，是由淡黄色链霉菌 Streptomyces flavolus DSM 9卯4产生的聚酮-聚肽类杂合天然产物(J. Antibiot. (Tokyo) 1999，52，466-473)。在目前已经分离到了 20余种SFA结构类似物(J. Am. Chem. Soc. 2002，124,4257-4270)中，以SFA的免疫抑制活性最高。除了具有很强的免疫抑制活性外(J. Immunol. 2001，166,7165-7171 J. Immunol. 2003，171，542-546)，SFA 还具有很强的抑制 HIV (J. Virol. 2004，78，12800-12808)，HCV (Intern. Patent. App 1. W0/2006/138507) 以及阻止由于线粒体MPTP病理性开孔导致的严重的心肌死亡的活性(J. Pharmacol. Exp. Ther. 2009，330，670-678.)。 与目前临床使用的免疫抑制剂环孢菌素(Cyclosporin Α,缩写成CsA)、FK506和雷帕霉素(Rapamycin，缩写成Rapa)相比，SFA既存在相似的作用机制也具有不同的效应机制(J. Am. Chem. Soc. 2003，125，3849-3859)。上述三种药物的发挥免疫抑制活性的方式都是先和一个初级蛋白作用而后再和效应蛋白作用发挥活性。Π(506和Rapa首先作用于一个共同的初级靶蛋白FKBP形成各自的复合物，随后n(506-FKBP作用于效应蛋白蛋白钙调磷酸酶(Calcineurin)而Rapa-FKBP则作用于FRAP发挥免疫抑制活性。相似的CsA和 SFA都作用于一个相同的初级靶蛋白CypA，CsA-CypA复合体再和Calcineurin作用发挥免疫抑制活性，然而SFA-CypA复合物的效应蛋白不同于上述三种药物，至今还未阐明。由于上述三种免疫抑制剂作用的效应蛋白Calcineurin和FRAP具有非常关键的生理作用，因此这些药物通常也可以导致一些严重的肾毒性和中枢毒性副作用(Circulation 1996，94， 1209-1211) ；SFA具有不同的作用机制，不存在类似的毒副作用，因此其有望被开发成为新一代高效低毒的免疫抑制剂。
技术介绍
SFA的化学合成最初由Nicolaou小组在1999年首次完成(Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999，38，2447-2451)，全过程 54 步，总产率 0. 9% 2 年后 Paquette 小组又以 64 步、0. 06% 的收率完成了全合成(J.Am. Chem. Soc. 2002,1 ，4257-4270)。由于 SFA 化学结构复杂，因此以化学合成方式制备SFA以及其结构类似物非常的不经济和不高效。相反以生物合成为基础的代谢工程和组合生物合成方法往往可以方便的引入结构多样性。本专利技术人此前克隆了 SFA的生物合成基因簇并解析了其生物合成基机理(Mol. BioSyst. 2011，7， 852-861)。其生物合成是由一型聚酮合成酶0 和聚肽合成酶NRPS催化完成的。首先利用巴豆先辅酶A为底物，经过巴豆先辅酶A还原酶的还原羧化，再由氨化酶的酰氨化合成起始单元；而后PKS利用丙二酰，甲基丙二酰辅酶A和2-氧-丁基丙二酰辅酶A为缩合底物经过13步的缩合形成聚酮长链；再经过NRPS催化完成3肽缩合将缬氨酸，m-酪氨酸和哒嗪酸依次缩合至聚酮-聚肽链上；最后在末端缩合功能域的催化下完成分子内环化形成大环内酯。由于S. flaveolus在产生SFA的同时还产生了大量的其他杂质化合物，因此在实际生产过程中，分离纯化SFA需要多步复杂工序，成本高昂。此前国际上曾报道，通过敲除阿维菌素(Avermectin)产生菌S. avermitilis中编码聚酮杂质组份的生物合成基因可以彻底去除发酵组份中相应的杂质，大大提高了阿维菌素的比率并简化后续纯化工艺(Chem. Rev. 1997，97，2591-2610)。因此本专利中，本专利技术人采用类似的思路，从分离纯化鉴定杂质组份的结构出发，克隆杂质组份的生物合成基因簇，利用基因敲除手段阻断了杂质氨莎三烯的生物合成，达到了净化萨菲菌素发酵组份的目的。利用本专利技术人专利技术的从转录组中克隆活跃表达的生物合成基因簇的方法(论文已投稿)，首先克隆到了 5对活跃转录的新的一型聚酮合成酶(H(S)和一对新的非核糖体聚肽合成酶(NRPS)基因。通过对SFA发酵液中主要的杂质组份分离纯化和结构鉴定，证实了这些主要杂质为如下结构式的氨莎三烯类抗生素具体为1 三烯环菌素ACTrienomycin A)，2 三烯环菌素B (Trienomycin B)，3 氨莎三烯A (Ansatrienin A)和4 硫噻唑三烯环菌素E (Thiozinotrienomycin E)。而后利用上述PKS和NRPS基因片段作为探针筛选基因文库，克隆到了一个包含上述所有PKS和NRPS基因片段的85. 398kb的生物合成基因簇(5 组PKS基因分别位于基因簇中mycDl，mycD2，mycD3, mycD4, mycD5基因中，NRPS基因位于mycC基因中)。根据基因序列的分析，推测其极可能为氨莎三烯类杂质的生物合成基因簇。权利要求1.一株来源于淡黄色链霉菌Mi^ptomyces flaveolus的基因工程突变菌株，一株基因置换的突变菌株的菌种保藏编号为CGMCC 4948，或者一株对淡黄色链霉菌Mi^ptomyces flaveolus氨莎三烯生物合成基因簇中mycC、mycDl、mycD2、mycD3、mycD4和mycD5基因进行基因中断获得的突变菌株。2.如权利要求1所述的突变菌株，其特征在于所述的保藏编号为CGMCC4948突变菌种对淡黄色链霉菌氨莎三烯生物合成基因簇中myCA2-myCD2即包含mycA2，mycA3, mycA4, mycBl, mycB2, mycB3, mycB4, mycB5, mycFl, mycC, mycB6, mycB7, mycDl 禾口 mycD2 基因区域进行基因置换，可以获得不产氨莎三烯的突变菌株。3.如权利要求2所述的突变菌株，其特征在于缺失了权利要求2中所述的 mycA2-mycD2基因区域，其基因簇中还剩余了 17个完整的基因和2个不完全的基因。具体为1)负责聚酮骨架形成的I型线性聚酮合成酶0 基因，即myCD3，myCD4，myCD5和一个缺失了部份氮端序列的mycD2共4个基因mycD3位于基因簇核苷酸序列第7771-17814个碱基处，长度为10044个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为3347个氨基酸；mycD4位于基因簇核苷酸序列第17859-27881个碱基处，长度为10023个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为3340个氨基酸；myc本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一株来源于淡黄色链霉菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｌａｖｅｏｌｕｓ的基因工程突变菌株，一株基因置换的突变菌株的菌种保藏编号为ＣＧＭＣＣ　４９４８，或者一株对淡黄色链霉菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｌａｖｅｏｌｕｓ氨莎三烯生物合成基因簇中ｍｙｃＣ、ｍｙｃＤ１、ｍｙｃＤ２、ｍｙｃＤ３、ｍｙｃＤ４和ｍｙｃＤ５基因进行基因中断获得的突变菌株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文，瞿旭东，雷春，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：31