本发明专利技术涉及一种重组克雷伯氏肺炎杆菌及其制备方法和应用，该重组克雷伯氏肺炎杆菌中含有可以功能性表达的漆酶基因,所述的漆酶基因为细菌来源的漆酶基因。该重组克雷伯氏肺炎杆菌在其利用木质纤维素原料水解液进行2,3-丁二醇等化学品的生产时，其表达的漆酶蛋白能够氧化所述水解液中的酚类物质，即该重组菌具有一定的抗酚类物质的抗性，降低了酚类物质对其生产的抑制作用，提高了其利用木质纤维素原料进行生产化学物质的能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种酚类物质抗性的重组克雷伯氏肺炎杆菌及其制备方法和应用。
技术介绍
克雷伯氏肺炎杆菌Of. pneumoniae)是一种革兰氏阴性细菌，是克雷伯氏菌属的模式种，属于肠杆菌科。克雷伯氏肺炎杆菌是自然界中分布广泛性仅次于大肠杆菌的一种细菌。克雷伯氏肺炎杆菌目前主要作为2，3-丁二醇和1，3-丙二醇等化学品的生产用菌， 同时克雷伯氏肺炎杆菌可以代谢合成3-羟基丙醛、乙醇、乙偶姻、琥珀酸、乙酸、乳酸、氢气等化学品，克雷伯氏肺炎杆菌还可以作为宿主细胞构建3-羟基丙酸等化合物生产菌。其中，2，3-丁二醇是重要的化工或医药中间体原料。例如，DL构型的2，3_ 丁二醇具有很低的熔点(一 60°C )，可以作为良好的防冻剂；2，3- 丁二醇的脱水产物1，3- 丁二烯是合成橡胶的重要原料；2，3-丁二醇具有较高的燃烧热(2718 J/g)并且具有较高的辛烷值，使其成为一种环境友好的燃料添加剂；另外2，3-丁二醇还应用于药物合成等领域。克雷伯氏肺炎杆菌可以利用葡萄糖等多种碳源发酵生产2，3- 丁二醇，使用葡萄糖可以生产高达150g/L的2，3-丁二醇，生产强度达到4.218/1.11 (Ma, C., et al., Enhanced 2, 3~butanediol production by Klebsiella pneumoniae SDM. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009. 82(1) : p. 49-57)。特别是，克雷伯氏肺炎杆菌可以利用纤维素和半纤维素水解产物的几乎所有营养成分来合成2，3-丁二醇，包括葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖和木二糖等寡糖以及糖醛酸和乙酸等(Yu，Ε. and J. Saddler, Biomass conversion to butanediol by simultaneous sac char i fi cat i on and fermentation· Trends in Biotechnology, 1985. 3(4): p. 100-104.)。由于克雷伯氏肺炎杆菌不具有纤维素酶水解酶，因此，含有纤维素和半纤维素的生物质原料(例如木质纤维素原料)都需要进行预处理并水解成简单糖类才能被兄 pneumoniae利用。例如，木材水解液、秸秆水解液都能用于2，3- 丁二醇的生产。克雷伯氏肺炎杆菌利用一种木材水解液为原料发酵生产2，3-丁二醇的水平为 13. 3g/L, 0. 28 g/L h (Groverj B.，S. Gargj and J. Vermaj Production of 2， 3~butanediol from wood hydrolysate by Klebsiella pneumoniae. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1990. 6(3) : p. 328-332.)。克雷伯氏肺炎杆菌利用一种松水解液为原料发酵生产2，3-丁二醇的水平为7. 8 g/L，0. 11 g/L.h (Trm，A. md R. Chambers, Lignin and extractives derived inhibitors in the 2，3-butanediol fermentation of manηose~rich prehydroIysates. Applied Microbiology and Biotechnology, 1986. 23(3) : p. 191-197.)。可以看出，克雷伯氏肺炎杆菌利用木质纤维素原料生产2，3- 丁二醇的发酵水平很低。经过研究发现，导致克雷伯氏肺炎杆菌对木质纤维素原料水解产物的利用能力很低的一个重要原因是木质纤维素原料水解产物中所含酚类物质对克雷伯氏肺炎杆菌有很强的抑制作用(Tran, A. and R. Chambers, Lignin and extractives derived inhibitors in the 2， 3—butanediol fermentation of mannose~rich prehydrolysates. Applied Microbiology and Biotechnology, 1986. 23(3): p. 191-197.)。目前，本领域亟需抗酚类物质的克雷伯氏肺炎杆菌基因工程菌。
技术实现思路
本专利技术提供了一种重组克雷伯氏肺炎杆菌，所述的重组克雷伯氏肺炎杆菌中含有可以功能性表达的漆酶基因，所述的漆酶基因为细菌来源的漆酶基因。所述的漆酶，是一类含铜的氧化还原酶，属于铜蓝氧化酶家族。其能够对酚类物质进行氧化，使得酚类物质聚合或分解。本专利技术的重组克雷伯氏肺炎杆菌，其中重组了细菌来源的漆酶基因，能够表达漆酶蛋白，因此，在其利用木质纤维素原料进行水解生产时，其产生的漆酶蛋白能够氧化所述木质纤维素原料水解液中的酚类物质，即该重组菌具有一定的抗酚类物质的抗性，降低了酚类物质对其的抑制作用，提高了其对木质纤维素原料水解液的利用能力，提高了其利用木质纤维素原料水解液来生产相应化学物质(诸如2，3- 丁二醇、1，3-丙二醇等)的能力。所述的漆酶基因为细菌来源的漆酶基因，其为相应的漆酶蛋白的编码序列。所述的漆酶蛋白为与所来源的细菌漆酶基因编码的漆酶蛋白具有相同的氨基酸序列的蛋白质，或者所来源的细菌漆酶基因编码的漆酶蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的且具有漆酶功能的衍生蛋白质。在本专利技术的一个具体实施方案中，所述的漆酶基因来源于肠杆菌、固氮螺菌、芽孢杆菌、克雷伯氏菌等属细菌。本专利技术还提供了上述的重组克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法，该制备方法包括两个基本步骤(1)获得细菌来源的漆酶基因；(2)将获得的漆酶基因连接到合适的表达载体上，再将所述的带有漆酶基因的表达载体转入克雷伯氏肺炎杆菌胞内，获得重组克雷伯氏肺炎杆菌，所述的合适的表达载体为在克雷伯氏肺炎杆菌中可以稳定存在的，具有高拷贝数的表达载体。在本专利技术的一个具体实施方式中，步骤(1)中获得漆酶基因的方式为人工合成。在本专利技术的另一个具体实施方式中，步骤(1)中获得漆酶基因的方式为从细菌基因组中进行克隆。这两种方式都是本领域技术人员获取目标基因的常规手段。所述的合适的表达载体是指，能够转化到克雷伯氏肺炎杆菌内并能稳定的存在，具有较高的拷贝数，并使得所携带的漆酶基因能够在克雷伯氏肺炎杆菌内进行功能性表达的载体。所述的高拷贝数质粒是指，在细胞分裂前一个质粒能复制成10个以上拷贝数的质粒，也称为松弛型质粒。优选的，在本专利技术的一个具体实施方案中，所述的表达载体为表达质粒。所述的表达质粒优选pDK6表达质粒、pDK7表达质粒，或者其他本领域技术人员所熟知的适宜转化到克雷伯氏肺炎杆菌且能够表达目的基因的其他质粒。至于将表达质粒转入克雷伯氏肺炎杆菌中的方式，可以采用电转化、热击转化或者接合方法转入克雷伯氏肺炎杆菌。本专利技术还提供了上述重组克雷伯氏肺炎杆菌在利用木质纤维原料的水解产物生产化学品方面的应用。例如，利用木质纤维原料水解液生产2，3- 丁二醇等化学品。在本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种重组克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述的重组克雷伯氏肺炎杆菌中含有可以功能性表达的漆酶基因，所述的漆酶基因为细菌来源的漆酶基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郝健，史吉平，
申请(专利权)人：上海中科高等研究院，
类型：发明
国别省市：31
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