一种山羊TLR4基因敲除载体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种山羊TLR4基因敲除载体及其构建方法，采用CRISPR/cas9系统，首先设计TLR4基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列，构建同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY‑sgRNA，连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，最后对转化子进行验证；酶切和测序鉴定证明TLR4基因敲除载体构建正确。本发明专利技术采用CRISPR/Cas9构建的载体，为后续获得山羊TLR4基因缺失型肺泡上皮细胞系，研究支原体肺炎感染的免疫应答分子机制提供理论依据。

【技术实现步骤摘要】
一种山羊TLR4基因敲除载体及其构建方法
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种山羊TLR4基因敲除载体及其构建方法。
技术介绍
Toll样受体(TLRs)是天然免疫系统中的一种重要模式识别受体，可选择性识别病原微生物而启动天然免疫,在宿主天然免疫和获得性免疫中具有重要作用。TLR4是TLRs家族的重要成员之一，是内毒素脂多糖(LPS)最重要的模式识别受体，在介导阴性菌及其LPS的宿主反应中发挥关键作用。CRISPR/Cas9系统是细菌在噬菌体长期的选择压力下进化出来的一种有效抵御外源DNA入侵的免疫机制之一。在菌体内，CRISPR簇在其前导区的调控下转录成precrRNA，并在tracrRNA和Cas9参与下加工成成熟的crRNA，引导crRNA/tracrRNA/Cas9复合体识别结合外源DNA特定序列，剪切DNA双链，从而沉默外源基因的表达。CRISPR/Cas9系统被开发成了一种新型的基因打靶系统。相对于较早的RNAi、ZFN和TALEN系统，这种新型打靶系统具有操作简单、成本低、效率高、可同时沉默任意数量基因等优点。目前，该项技术已经应用于细菌、斑马鱼、小鼠、大鼠、家蚕以及哺乳动物和人类细胞系等，且都表现出较强的基因组编辑活性。Hu等(2014)应用该技术对山羊成纤维细胞中NUP155基因进行了敲除，发现23个单细胞克隆中有5个发生了NUP155基因突变。Wang等(2015)采用CRISPR/Cas9技术对山羊MSTN和FGF5基因进行了敲除。以上研究提示该技术可以成功用于山羊基因敲除。目前采用ZFNs或TALENs进行基因敲除，对每个基因位点编辑都需要设计和组装两个核酸酶,构建技术难度较大、构建组装时间较长。另外，传统基因敲除，主要是应用基因重组原理通过插入突变和靶向技术使目的基因功能丧失。然而，目前在山羊上关于TLR4基因敲除及相关功能研究尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种山羊TLR4基因敲除载体及其构建方法，旨在解决目前采用ZFNs或TALENs进行基因敲除，对每个基因位点编辑都需要设计和组装两个核酸酶,因而构建技术难度较大、构建组装时间较长；而且传统基因敲除，主要是应用基因重组原理通过插入突变和靶向技术使目的基因功能丧失的问题。本专利技术是这样实现的，一种山羊TLR4基因敲除载体，该山羊TLR4基因敲除载体的sgRNA核苷酸序列为：TLR4-gRNA-Lg1：GACTCATATTCAGCACCTGAAGG；TLR4-gRNA-Rg1：TCACAACAAACTCTTGTCATTGG。一种引物Oligo，该引物Oligo序列为：F-TLR4-gRNA-L1：CACCGACTCATATTCAGCACCTGA；R-TLR4-gRNA-L1：AAACTCAGGTGCTGAATATGAGTC；F-TLR4-gRNA-R1：CACCGTCACAACAAACTCTTGTCAT；R-TLR4-gRNA-R1：AAACATGACAAGAGTTTGTTGTGAC。一种表达sgRNA核苷酸的质粒PYSY-sgRNA，该质粒PYSY-sgRNA为：pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-L2-SV40-Neo质粒和pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-R2-EF1a-eGFP质粒。本专利技术另一目的在于提供一种山羊TLR4基因敲除载体的构建方法，该山羊TLR4基因敲除载体的构建方法包括：采用CRISPR/cas9系统，首先设计TLR4基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列；构建同时表达sgRNA和Cas9D10A的质粒PYSY-sgRNA，连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞；最后对转化子进行验证。进一步，该山羊TLR4基因敲除载体的构建方法具体包括：引物退火：将1ul100uM的F-Oligo、1ul的100uMR-Oligo、8ulYSYoligo退火缓冲液混合于PCR管内，在PCR仪中以每分钟1.5℃逐渐从95℃降至22℃；连接：0.5ul退火产物，1ulYSY线性化三合一CRISPR/Cas9n质粒，1ulT4连接酶，2ul5*T4Buffer，5.5ulMilliQ；转化：室温15min后用pfu≥108的大肠杆菌DH5a感受态细胞进行转化；转化子验证：转化涂板后挑取单克隆进行10ul体系菌液PCR验证；经PCR初步鉴定后进行测序；菌液37℃过夜培养，无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，并采用微量紫外分光光度计测定质粒浓度。进一步，所述转化涂板后挑取单克隆进行10ul体系菌液PCR验证，具体包括：挑取单克隆0.5ul菌液，0.5ulYSY验证正向引物，0.5ulR-Oligo，5ulMastermix，3.5ulMilliQ；PCR反应条件为：1)：95℃预变性2mim；2)：94℃变性30s；3)：56℃退火30s；4)：72℃延伸30s；步骤2)到步骤4)运行35个循环；5)：72℃再延伸10min；6)：4℃保存。本专利技术提供的山羊TLR4基因敲除载体及其构建方法中CRISPR/Cas9系统，是新开发的一种新型的基因打靶系统，利用细菌或古生菌中存在的的CRISPR簇，在其前导区的调控下转录成precrRNA，并在tracrRNA和Cas9参与下加工成成熟的crRNA，cRNA和tracrRNA二者结合形成的复合物成为，sgRNA与Cas9核酸内切酶结合,并引导其识别结合外源DNA特定序列，剪切DNA双链，从而沉默外源基因的表达。本专利技术采用CRISPR/Cas9系统构建TLR4基因敲除载体，方法简单快捷，只需针对该基因敲除位点设计一个长约20bp左右的sgRNA，然后连接通用的Cas9基因即可，而采用ZFNs或TALENs进行基因敲除，对每个基因位点编辑都需要设计和组装两个核酸酶,构建技术难度较大、构建组装时间较长。因此，与传统的ZFNs、TALENs等基因敲除技术比较而言，采用CRISPR/Cas9构建基因敲除载体更为简单快捷，便于进一步推广和应用于后续实验。另外，传统基因敲除，主要是应用基因重组原理通过插入突变和靶向技术使目的基因功能丧失，与ZFN和TALEN这两种人工核酸酶相比，CRISPR/Cas9系统中的Cas9作为切口酶，具有单链切割活性，可以在特定位置制造单链切口，这样基本不会引起非同源末端连接，从而高效地介导外源基因的定点敲入，或对基因组进行点突变，大大降低了非同源末端连接所带来的风险。本专利技术构建的载体，利用RNA导向的CRISPR-Cas9系统形成双切口，在未影响靶向切割效率的前提下大大降低了脱靶效应，提高基因敲除效率。本专利技术采用CRISPR/Cas9系统构建TLR4敲除载体，为后续获得山羊TLR4基因缺失型肺泡上皮细胞系、研究山羊肺炎支原体感染的免疫应答分子机制提供理论依据。附图说明图1是本专利技术实施例提供的山羊TLR4基因敲除载体的构建方法流程图；图2是本专利技术实施例提供的PCR验证克隆电泳图片示例一；图中：Marker：Trans2KPlusDNAMarker，从下到上依次为100bp,250bp,500bo,750bp,1000bp,3000bp,5000bp；2:阴性对照；3-6:TLR4-gRNA-Rg1克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种山羊TLR4基因敲除载体，其特征在于，该山羊TLR4基因敲除载体的sgRNA核苷酸序列为：SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。

【技术特征摘要】
1.一种山羊TLR4基因敲除载体，其特征在于，该山羊TLR4基因敲除载体的sgRNA核苷酸序列为：SEQIDNO1和SEQIDNO2。2.一种包含权利要求1所述的sgRNA核苷酸合成对应的引物Oligo，其特征在于，该引物Oligo序列为：SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6。3.一种表达权利要求1所述的sgRNA核苷酸的质粒PYSY-sgRNA，其特征在于，该质粒PYSY-sgRNA为：pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-L2-SV40-Neo质粒和pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-R2-EF1a-eGFP质粒。4.一种如权利要求1所述的山羊TLR4基因敲除载体的构建方法，其特征在于，该山羊TLR4基因敲除载体的构建方法包括：采用CRISPR/cas9系统，首先设计TLR4基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列；构建同时表达sgRNA和Cas9D10A的质粒PYSY-sgRNA，连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞；最后对转化子进行验证。5.如权利要求4所述的山羊TLR4基因敲除载体的构建方法，其特征在于，该山羊TLR4基因敲除载体的构建方法具体包括：...

【专利技术属性】
技术研发人员：惠文巧，陈胜，汤继顺，班谦，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34