表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系，其为导入携带有山羊SLAM基因的真核表达载体的Vero‑E6细胞系。本发明专利技术成功构建了表达小反刍兽疫病毒的山羊SLAM受体的Vero‑E6细胞系，接种小反刍兽疫病料后，可在48h出现明显细胞病变。该细胞系不但可用于小反刍兽疫病毒的分离和鉴定，还能够有效缩短分离病毒的时间，并可提高病毒的产量，有望应用于大规模生产疫苗。

【技术实现步骤摘要】
表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用
本专利技术属于生物工程
，具体地说，涉及能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用。
技术介绍
小反刍兽疫(pestedespetitsruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(pestedespetitsruminantsvirus，PPRV)引起的一种严重的烈性、接触性传染病，特征为发热、口腔及舌黏膜糜烂、流泪、流鼻涕、腹泻和肺炎。该病是世界动物卫生组织(OIE)法定报告的动物疫病，我国将其列入一类动物疫病。2013年12月新疆暴发小反刍兽疫以来，我国各地相继出现小反刍兽疫疫情，因此PPR防控显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法。本专利技术的另一目的是提供所述能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系在小反刍兽疫病毒的分离及其疫苗生产中的应用。为了便于研究淋巴细胞活化分子(SLAM)在Vero-E6细胞膜上的表达及其在分离病毒中的作用机制，本专利技术利用pDisplay载体使SLAM基因与其含有鼠Igk引导序列的基因形成融合基因，pDisplay载体大小为5.3kb，能在哺乳动物细胞表面表达蛋白，能稳定准确地在细胞表面表达所需的目的蛋白，因此表达的重组蛋白组成几乎与原蛋白一致。此外，利用pDisplay载体的G418抗性，筛选培养出转染重组pDisplay载体的细胞株。G418是一种氨基糖苷类抗生素，在分子遗传试验中常被用作选择性标记基因抗性筛选。它对原核细胞和真核细胞均具有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞等。当neo基因被整合进真核细胞DNA后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物的高效表达，使细胞获得抗性而能在含G418的选择性培养基中生长，与阳性细胞克隆的筛选有着直接的关系。G418这一选择特性，已在基因转移、抗性筛选等方面得以广泛应用。并且，由于该载体N-端带有禽流感病毒HA标签蛋白，可用于阳性细胞系的筛选。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种重组质粒pDisplay-gSLAM，所述重组质粒是携带有山羊SLAM基因的真核表达载体pDisplay。其中，所述山羊SLAM基因插入到载体pDisplay的SmaI和SacII酶切位点之间。本专利技术还提供能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系gSLAM/Vero-E6，其为导入携带有山羊SLAM基因的真核表达载体的Vero-E6细胞系(或BHK-21细胞系)。所述携带有山羊SLAM基因的表达载体为上述重组质粒pDisplay-gSLAM。本专利技术中涉及的山羊SLAM基因，其GenBank登录号为NM_204596。本专利技术还提供所述细胞系gSLAM/Vero-E6的构建方法，包括Vero-E6细胞的转染、细胞阳性克隆的筛选及鉴定等步骤。用含G418的DMEM培养基筛选细胞阳性克隆，并通过间接免疫荧光法和/或Westernblot法进行阳性克隆的鉴定。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述细胞系的构建方法，包括以下步骤：⑴山羊外周血淋巴细胞的分离无菌颈静脉采集山羊抗凝血，使用红细胞裂解液，按说明书操作分离得到外周血淋巴细胞；⑵山羊SLAM基因PCR扩增经ConA(伴刀豆蛋白)刺激后，按照RNA提取试剂盒说明书操作提取山羊外周血淋巴细胞的总RNA，用RandomPrimer(6mer)pd(N)6反转录引物合成cDNA第一链后，用引物对SLAM-F/R(SEQIDNO:1-2)扩增全长SLAM基因；上游引物SLAM-F:5′-CACCCCTTATCCTCACTGG-3′下游引物SLAM-R:5′-CAGAGAGCTGACATCACAGACTT-3′⑶重组表达载体pDisplay-gSLAM的构建及在Vero-E6细胞上的表达；再用引物对SLAM-UP/DOWN(SEQIDNO:3-4)扩增不含信号肽的山羊SLAM基因；上游引物SLAM-UP:5′-TCCCCCGGGTTGACCAGTTCCACAAAGA-3′(SmaI)下游引物SLAM-DOWN:5′-ACGCGTCGACTAGTCCCCATTGTCTTGATTCT-3′(SacII)PCR产物及pDisplay真核表达载体经SmaI和SacII双酶切，进行连接，构建表达山羊SLAM基因的重组质粒pDisplay-gSLAM；⑷Goat-SLAM/Vero-E6细胞阳性克隆的筛选和培养将pDisplay-SLAM重组质粒转染细胞后，用含800μg/mLG418的DMEM培养基(含2％FBS)连续培养周后，换为含600μg/mLG418的DMEM培养基(含10％FBS)进行单细胞的克隆和扩大培养。将扩大培养的细胞按常规进行消化、传代，连续培养4周后对细胞进行冻存、复苏。反复冻存、复苏3次后，采用间接免疫荧光法和Westernblot法检测山羊SLAM基因的表达情况。细胞系在山羊淋巴细胞活化分子稳定表达的初期要使用含600μg/mLG418的DMEM培养基(含10％FBS)，来稳定受体的表达。在稳定表达的后期，降低G418在DMEM培养基中的浓度，直至不添加G418。将不同时期稳定表达SLAM受体的细胞系冻存于液氮中。本专利技术进一步提供所述细胞系gSLAM/Vero-E6在小反刍兽疫病毒的分离及其疫苗生产中的应用。用gSLAM/Vero-E6细胞系对小反刍兽疫病毒进行分离情况如下：将铺满单层的gSLAM/Vero-E6细胞系传代后，经37℃5％CO2过夜培养，细胞汇合度达80～90％时，吸附TCID50为4.5的野生型和疫苗株(Nigeria75/1)PPRV，使用含2％FBS的DMEM培养基继续培养观察，以Vero-E6细胞作为对照，实验结果显示，野生型和疫苗株PPRV都能在Goat-SLAM/Vero-E6细胞系上增殖，野生型和疫苗株PPRV均可产生明显细胞病变，而且病变产生较快。在相同时间内，野生型和疫苗株PPRV在Vero-E6细胞上产生病变不明显。本专利技术成功构建了表达小反刍兽疫病毒的山羊SLAM受体的Vero-E6细胞系Goat-SLAM/Vero-E6，接种小反刍兽疫病料后，可在48h出现明显细胞病变，并采用qRT-PCR方法检测基因SLAM的表达情况。Goat-SLAM/Vero-E6细胞系不但可用于小反刍兽疫病毒的分离和鉴定，还能够有效缩短分离病毒的时间，并可提高病毒的产量，有望应用于大规模生产疫苗。附图说明图1为本专利技术实施例1中山羊全长SLAM基因的克隆结果。图2为本专利技术实施例1中克隆载体pEASY-T5-gSLAM的酶切鉴定结果。图3为本专利技术实施例1中表达载体pDisplay-gSLAM的酶切鉴定结果。图4为本专利技术实施例1中gSLAM/Vero-E6细胞系的基因组RT-PCR检测SLAM基因表达情况。图5为本专利技术实施例1中gSLAM/Vero-E6细胞系的间接免疫荧光鉴定结果。其中，A:gSLAM/Vero-E6细胞系的间接免疫荧光鉴定SLAM的表达图；B:正常Vero-E6细胞的间接免疫荧光鉴定图。图6为本专利技术实施例1中gSLAM/Vero-E6细胞系SLAM表达的Westernblot鉴定结果。其中，1:正常Vero-本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组质粒pDisplay‑gSLAM，其特征在于，所述重组质粒是携带有山羊SLAM基因的真核表达载体pDisplay。

【技术特征摘要】
2016.08.22 CN 20161070431871.重组质粒pDisplay-gSLAM，其特征在于，所述重组质粒是携带有山羊SLAM基因的真核表达载体pDisplay。2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述山羊SLAM基因位于载体pDisplay的SmaI和SacII酶切位点之间。3.能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系，其特征在于，其为导入携带有山羊SLAM基因的真核表达载体的Vero-E6细胞系或BHK-21细胞系。4.根据权利要求3所述的细胞系，其特征在于，所述山羊SLAM基因表达载体为权利要求1或2所述的重组质粒p...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯绍华，金红岩，封家旺，姜一曈，贾红，梁瑞英，隋修锟，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11