【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及牛分枝杆菌检测，具体涉及一种重组酶聚合酶扩增引物对及其应用，一种可视化检测牛结核病的crispr-cas13系统，以及一种可视化检测牛结核病的试剂盒及其应用。
技术介绍
1、牛结核病(bovine tuberculosis，btb)是由牛分枝杆菌(mycobacteriumbovis，m.bovis)引起的一种慢性、传染性人畜共患病。
2、在我国，btb被认为是奶牛的地方性疾病，导致奶牛生产、贸易和遗传物质的巨大损失。还增加疾病监测和控制相关的成本，影响公共卫生安全。我国目前的牛结核病防控战策略是基于国家、地方和农场各级监测规划的检验和屠宰政策。检测牛分枝杆菌的“金标准”是牛分枝杆菌培养物。然而，由于该病原体具有高度持续性感染、生长缓慢和潜在危险的特点，该方法灵敏度低、繁琐且耗时，需要高水平的生物安全实验室设施。
3、目前，结核菌素皮肤试验(tst)和血液干扰素γ(ifn-γ)体外释放试验是国际贸易中推荐的常规测试。但tst的特异性低且耗时费力，ifn-γ体外释放试验需要专业技术人员和成本高。另外，基于血清或乳抗体的elisa已被广泛用于监测btb，但也需要48-72小时处理时间，而且兽医还必须经过专门培训才能进行检测。
4、而牛奶用于分枝杆菌检测具有量大、无创、方便采集等优点。针对牛分枝杆菌的pcr也可直接检测牛分枝杆菌感染，但同样需要训练有素的人员，相关费用(试剂和设备)也很高。尤其是牛奶中的钙、镁是聚合酶的主要抑制剂之一，因此基于奶样的pcr检测结果往往受牛奶中钙镁离子的影
5、因此，在控制和根除运动中改善和简化牛分枝杆菌的诊断是预防疾病发生的优先事项。基于奶样的crispr-cas13a系统结合可视化试纸条的检测，以其高灵敏度，高特异性且适应现场快速检测，准确检测的需要，为食品安全检测，流行病学的调查，掌握传播规律以及疫病的诊断和防控提供有力支持。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术存在的牛结核病检测时间长、专业性高以及灵敏度低的不足，提供了rpa引物对及其应用、可视化检测牛结核病的试剂盒及其应用，具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测时间短，结果可肉眼观察的优点，弥补了常规检测方法的不足，对于牛结核病的防控和治疗有很好的实用价值。
2、本专利技术目的之一在于：提供一种重组酶聚合酶扩增引物对，包括rpa f和rpa r，rpa f的核酸序列如seq id no.1所示，rpa r的核酸序列如seq id no.2所示。
3、优选地，引物对的目标基因为牛分枝杆菌的mpb70基因。
4、本专利技术目的之二在于：提供上述重组酶聚合酶扩增引物对在制备可视化检测或诊断牛结核病产品中的应用。
5、本专利技术目的之三在于：提供一种可视化检测牛结核病的crispr-cas13系统，包括：cas13a蛋白、crrna探针、rna报告分子；其中crrna探针由crrna引导序列和结合在前述crrna引导序列5’端的t7启动子构成，crrna引导序列的核酸序列如seq id no.3所示。
6、优选地，cas13a蛋白为lwcas13a核酸酶。
7、优选地，crispr-cas13还系统包括：rnase inhibitor、ntp buffer mix、t7 rnapolymerase mix。
8、本专利技术目的之四在于：提供一种可视化检测牛结核病的试剂盒，包括：恒温扩增体系，上述crispr-cas13系统，以及可视化系统；其中，恒温扩增体系包括：上述重组酶聚合酶扩增引物对。
9、优选地，可视化系统包括：横向流动试纸条。
10、优选地，上述试剂盒对牛分枝杆菌的检测下限为2.0×100copies/μl。
11、本专利技术目的之五在于：提供上述试剂盒在制备可视化检测或诊断检测牛结核病产品中的应用。
12、相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
13、1、本专利技术提供了一种基于rpa-crispr-cas13a体系可视化检测牛结核病的试剂盒及应用，特异性良好且最低检测限为2.0×100copies/μl，能够快速定性检测m.bovis。
14、2、与传统血清学和病原学牛结核检测方法相比，本专利技术采用的样本为对奶牛无创、应激小、量大、且方便采集。
15、3、与传统核酸检测pcr技术相比，本专利技术试剂盒制备及应用简单，可在60分钟内，37℃下条件下进行等温检测，判读方法直观，且能够避免奶样中钙镁离子对pcr反应的影响。能够实现m.bovis的高灵敏度、高特异性检测；能够对牛结核病的早期检测及后期流行病学调查提供了技术支撑，对食品安全检测、流行病学研究和临床诊断提供更可靠的指导。
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1.一种重组酶聚合酶扩增引物对，其特征在于，包括RPA F和RPA R，RPA F的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，RPA R的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述引物对，其特征在于，所述引物对的目标基因为牛分枝杆菌的MPB70基因。
3.如权利要求1或2所述重组酶聚合酶扩增引物对在制备可视化检测或诊断牛结核病产品中的应用。
4.一种可视化检测牛结核病的CRISPR-Cas13系统，其特征在于，包括：Cas13a蛋白、crRNA探针、RNA报告分子；
5.根据权利要求4所述CRISPR-Cas13系统，其特征在于，Cas13a蛋白为LwCas13a核酸酶。
6.根据权利要求4所述CRISPR-Cas13系统，其特征在于，CRISPR-Cas13还系统包括：RNase inhibitor、NTP buffer mix、T7 RNA polymerase mix。
7.一种可视化检测牛结核病的试剂盒，其特征在于，包括：恒温扩增体系，如权利要求4-6任一项所述CRISPR-Cas13
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，可视化系统包括：横向流动试纸条。
9.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒对牛分枝杆菌的检测下限为2.0×100copies/μL。
10.如权利要求7-9任一项所述试剂盒在制备可视化检测或诊断检测牛结核病产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种重组酶聚合酶扩增引物对，其特征在于，包括rpa f和rpa r，rpa f的核酸序列如seq id no.1所示，rpa r的核酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述引物对，其特征在于，所述引物对的目标基因为牛分枝杆菌的mpb70基因。
3.如权利要求1或2所述重组酶聚合酶扩增引物对在制备可视化检测或诊断牛结核病产品中的应用。
4.一种可视化检测牛结核病的crispr-cas13系统，其特征在于，包括：cas13a蛋白、crrna探针、rna报告分子；
5.根据权利要求4所述crispr-cas13系统，其特征在于，cas13a蛋白为lwcas13a核酸酶。
6.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：王洁茹，殷冬冬，尹磊，曾晓雨，沟姣姣，潘孝成，戴银，沈学怀，赵瑞宏，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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