本发明专利技术公开了表达多个目的基因的植物表达载体及其构建方法和应用。所述植物表达载体包括：植物转化载体p1354、克隆载体p1964A以及待转化的一个或多个目的基因。本发明专利技术利用同尾酶连接后原有酶切位点消失的特性，使酶切后的载体或片段的两端始终是不同的粘段，解决了现有的载体内切酶位点有限的问题，同时也避免了载体连接过程中的自连，无需再进行粘性末端的磷酸化处理，也无需中间载体及特殊的工程菌株，回避了大多数的限制性内切酶位点，简化了操作步骤并降低了实验难度。本发明专利技术植物表达载体可携带长达30kb的目的基因对植物进行遗传转化，技术成熟可靠，成本低廉，在普通的实验条件下即可完成，便于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植物表达载体，尤其涉及一种表达多个目的基因的植物表达载体及其构建方法，本专利技术还涉及该植物表达载体在转基因植物的培育和筛选中的应用，属于植物表达载体的构建及应用领域。
技术介绍
目前植物转基因研究主要是转化单个基因，功能单一，作用有限。多基因共同转化已成解决此问题的一条途径。构建多基因植物转化载体是实现多基因同时转化植物的基础与重要步骤，几乎所有的植物转基因研究都是从构建载体开始。以往多基因表达载体的构建受限制性酶切位点限制，载体携带基因数量少，有些构建过程转化还需要去磷酸化、磷酸化、粘性末端补平等操作，步骤繁琐，难度较高。而有些载体引入了“gateway技术”或采用“归位内切酶结合Cre重组技术”，虽然部分解决上述问题，但也存在成本较高、需要特殊的中间载体、特殊菌株等问题。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种表达单个或多个目的基因的植物表达载体；本专利技术目的之二是提供一种构建所述植物表达载体的方法；本专利技术目的之三是将所述的植物表达载体应用于转基因植物的培育或筛选。 本专利技术上述目的是通过以下技术方案来实现的表达单个或多个外源基因的植物表达载体，包括植物转化载体P1354、克隆载体P1964A以及待转化的一个或多个目的基因；其中，pl354为Ti质粒，源自载体pCAMBIA1301，在原有pCAMBIA1301载体的BamHI与EcoR I两个酶切位点之间引入一个带有Bspl20 I酶切位点的片段；pl354载体上有Bspl20 I与Xba I两个限制性内切酶位点；pl354带有植物筛选基因hptll。所述克隆载体pl964A起源于克隆载体pUCm-T ;该载体带有CaMV35S启动子及NOS终止序列，在35S启动子及NOS终止序列之间有2个Xcm I酶切位点，经单酶切形成T载体与目的基因PCR产物相连，构成完整的目的基因开放阅读框(0RF)，分别在开放阅读框的两侧依次携带有酶切位点Not I与Bsp120 I、Spe I及Nhe I酶切位点。本专利技术的另外一个目的是提供一种构建所述表达单个或多个目的基因的植物表达载体的方法，包括以下步骤(I)分别构建植物转化载体pl354或克隆载体pl964A ；(2)用内切酶Xcm I酶切克隆载体pl964A产生2个含T的3’突出端，形成T载体，与带有含A的3’突出端的第I个目的基因PCR产物相连，将第I个目的基因扩增片段完整并正向连入克隆载体中，构建成包括CaMV35S启动子+第I个目的基因+NOS终止序列的开放阅读框；利用Not I与Nhe I双切携带第I个目的基因表达开放阅读框(ORF)的克隆载体，回收第I个目的基因表达开放阅读框(ORF)片段，备用；(3)利用Bspl20 I与Xba I双切pl354，回收pl354酶切片段；将pl354酶切片段与步骤(2)回收的第I个目的基因表达开放阅读框(ORF)片段连接，pl354上原有的Bspl20I与Xba I位点及目的基因表达开放阅读框两端的Not I与Nhe I位点消失，而新构建成的植物表达载体上带有的Bspl20 I与Spe I位点，经过酶切又可以与第2个带有Not I与Nhe I位点的第2个目的基因表达开放阅读框(ORF)片段相连，如此不断重复，构建出携带多个目的基因的植物表达载体。其中，所述的植物转化载体pl354的构建方法包括在pCAMBIA1301载体的BamHI与EcoR I两个酶切位点之间引入一个带有Bspl20 I酶切位点的片段，即得。pl354为Ti质粒，源自载体pCAMBIA1301。自身带有植物筛选基因hptll，用于植物转化。在原有PCAMBIA1301载体的BamH I与EcoR I两个酶切位点之间引入一个带有Bspl20 I酶切位点的片段。pl354载体上有Bspl20 I与Xba I两个限制性内切酶位点，经内切酶Bspl20 I与Xba I双酶切后，会产生两个不同的粘性末端，与克隆载体上相应同尾酶末端片段连接后，位点会消失。所述克隆载体pl964A的构建方法包括先从载体pCAMBIA1302上克隆了带有CaMV35S启动子、GFP绿色荧光蛋白基因及NOS终止序列并引入了新酶切位点的片段；用一个两端都带有Xcm I位点的片段取代GFP绿色荧光蛋白基因，形成一个新片段，再通过酶切、连接把新片段连到PUCm-T上得到克隆载体pl964A。可以采用诸如热激法等方式把本专利技术所构建的植物表达载体转化农杆菌感受态，再利用农杆菌介导法转化植物，经过潮霉素(Hyg)抗性筛选，获得转基因植株。本专利技术植物表达载体利用同尾酶之间酶切后有相同的粘性末端，彼此连接后，原有酶切位点消失的特点构建携带多个目的基因的植物表达载体，专利技术植物表达载体可携带长达30kb的外源片段，对植物进行转化。本专利技术将目的基因PCR片段经过A-T克隆，直接连入克隆载体，完成目的基因的开放阅读框(ORF)的构建，经简单的PCR鉴定，即可用于进一步的植物转化载体构建。本专利技术多基因植物表达载体的构建过程中，采用Not I/Bspl20 I与Spe I/Xba I/Nhe I两个不同的同尾酶系统同时应用，利用同尾酶连接后原有酶切位点消失的特性，使酶切后的载体或片段的两端始终是不同的粘段，解决了以往载体内切酶位点有限的问题，同时也避免了载体连接过程中的自连，无需再进行粘性末端的磷酸化处理，也无需中间载体及特殊的工程菌株，回避了大多数的限制性内切酶位点，只需进行酶切、连接、转化等常规步骤。简化了操作步骤与降低实验难度，技术成熟可靠。成本低廉，在普通的实验条件下即可完成，便于推广，具有较大的科研与实际应用价值。本专利技术所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本专利技术的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。术语“宿主细胞”意指包含本专利技术多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。、术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA (肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ; Ohtsuka 等人，J. Biol.Chem. 260:2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ; Rossolini 等人，Mol本文档来自技高网...
【技术保护点】
表达单个或多个目的基因的植物表达载体，其特征在于，包括：植物转化载体p1354、克隆载体p1964A和待转化的一个或多个目的基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：董研，杨敏生，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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