人类ALK基因表达的检测引物、探针及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物技术及医学领域，具体公开了人类ALK基因表达的检测引物、探针及检测试剂盒。所述检测引物包括SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:8所示的序列，所述探针序列如SEQ ID NO:9‑SEQ ID NO:12所示，其5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ‑MGB。本发明专利技术的引物和探针可通过检测ALK基因5’端和3’端的表达差异，确定是否存在ALK基因融合。所述试剂盒含有上述检测引物与探针以及质控系统等。本发明专利技术可以检出低至5拷贝的突变，可耐受600ng基因组DNA和5μg野生型RNA的逆转录产物，整个逆转录PCR和荧光PCR检测过程只需要80分钟即可完成。

Detection primers, probes and detection kits for human ALK gene expression

The invention relates to the technical field of biology and medicine, in particular discloses a detection primer, a probe and a detection kit for human ALK gene expression. The primer sequences of SEQ ID including NO:1 SEQ ID NO:8 shows, the probe sequence of SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:12 shows, the 5 'end modified with FAM or VIC, 3' NFQ modified MGB. The primers and probes of the present invention can determine whether there is ALK gene fusion by detecting differences in the expression of '5' and '3' ends of the ALK gene. The reagent box contains the detection primer and probe and the quality control system and the like. The invention can detect a mutation as low as 5 copies, and can tolerate the reverse transcription of 600ng genome DNA and 5 g wild type RNA, and the whole reverse transcription PCR and fluorescence PCR detection process can be completed in only 80 minutes.

【技术实现步骤摘要】
人类ALK基因表达的检测引物、探针及检测试剂盒
本专利技术涉及生物技术及医学领域，具体地说，涉及人类ALK基因表达的检测。
技术介绍
间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，ALK)最早发现于间变性大细胞淋巴瘤(anaplasticlargecelllymphoma，ALCL)的一个亚型。ALK基因位于染色体2p23位点，含有29个外显子，可编码含1620个氨基酸，分子量为200KDa的I型跨膜蛋白ALK。ALK蛋白为一种受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase，RTK)，是RTK胰岛素超家族的成员。完整的ALK具有三部分结构，即胞外区、亲脂性跨膜区和胞内酪氨酸激酶，其氨基酸激酶结构域由254个(1123至1376位)氨基酸残基组成。ALK的蛋白表达与神经外胚层的分化有关，正常的ALK专一表达于神经系统中，如脑和神经索，尤其是新生儿的脑中，在正常人的其它组织中，ALK几乎不表达。ALK是重要的肿瘤相关基因，在许多恶性肿瘤中发现ALK基因的异常表达，包括ALCL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、炎性肌纤维母细胞瘤及神经母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)等。ALK基因异常引起的细胞过度增殖和凋亡下调是其主要致瘤原因。在3％-7％的NSCLC中，ALK基因可与其它基因发生融合，其中ALK基因的主要融合断裂点绝大多数位于20号外显子。ALK基因的融合会导致断裂点两侧的mRNA发生差异表达，其3’端(外显子20-29)的mRNA序列表达量明显高于5’端(外显子1-18)。故通过ALK基因5’与3’端的差异表达，可以定性检测ALK基因是否发生融合。ALK激酶抑制剂的效果与患者是否存在ALK基因融合密切相关。克唑替尼是一种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂，既可特异性靶向抑制ALK，也可抑制c-MET和ROS1等信号通路。克唑替尼分别于2011年和2013年被美国食品与药品管理局(FDA)和中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准上市，用于治疗ALK阳性的局部晚期或转移性NSCLC患者。2015年的《中国间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性非小细胞肺癌诊疗指南》中建议晚期非小细胞肺癌患者使用ALKTKI治疗前必须检测ALK融合变异状态。推荐所有含腺癌成分的非小细胞肺癌患者在诊断时常规进行ALK融合基因或融合蛋白检测(1类证据)。目前ALK基因检测方法主要有荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学法(IHC)、EML4-ALK融合基因RT-qPCR方法以及ALK基因表达荧光PCR法。虽然FISH检测仍是经典ALK诊断手段，但仍有以下缺点。1)FISH检测对于操作和判读技术要求较高；2)晚期NSCLC患者通常只能提供2mm左右的小活检组织，很难保证每个视野均存在50个以上的肺癌细胞进行判读。3)FISH检测结果的判断界值(cut-off值)也存在商榷之处，已有多项研究发现少数ALKFISH阴性、IHC阳性的患者也能从克唑替尼治疗中明显获益。4)目前FISH检测的成本昂贵。IHC法包括VentanaIHC和普通IHC法。虽然VentanaIHC具有操作简便、检测的准确度较高、相对于其他诊断方法价格便宜等优势，但VentanaIHC需要专门的自动化染色仪器，这在一定程度限制了它在临床上的广泛使用。常规IHC存在灵敏度偏低，关键实验操作需要统一规范的问题。RT-qPCR法操作简单、灵敏度高，可以检测已知的ALK融合变体类型，但无法检测未知的融合型是其最大的不足之处。CN103290120A公开了用于检测人类ALK基因表达的引物、探针及检测试剂盒，使用荧光PCR法进行ALK基因表达检测，可检出浓度为5拷贝/μL，总量为25拷贝的阳性质粒。但该方法有以下不足：1)检测过程耗时较长，需要160分钟。2)未对体系的特异性进行验证，如体系对基因组DNA耐受性，对野生型样本的耐受性。3)未引入质控体系，对样本的质量进行监控，可能会因样本质量较差，产生假阴性结果。4)体系的结果判读方式比较复杂，临床适用性稍差。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供人类ALK基因表达的检测引物、探针及检测试剂盒。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供了用于检测人类ALK基因表达的引物组合，包括SEQIDNO:1-SEQIDNO:8所示的序列。不仅如此，本专利技术还提供了与所述引物组合配合使用的特异性探针，如SEQIDNO:9-SEQIDNO:12所示，所述探针的5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。第二方面，本专利技术提供了用于检测人类ALK基因表达的试剂盒，其含有前述的引物组合与特异性探针。为了提高所述试剂盒的检测准确度，所述试剂盒还含有质控系统，阳性对照液和空白对照液。所述质控系统包含质控引物和质控探针，质控引物的序列如SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示，所述质控探针的序列如SEQIDNO:15所示，所述质控探针的5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。所述阳性对照液含有3种质粒DNA混合液，所述3种质粒DNA分别含有ALK基因外显子13-外显子15序列、ALK基因外显子25-外显子27序列，以及B2M基因的一段序列，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。上述3种质粒可为本领域技术人员熟知的质粒。进一步地，所述试剂盒还包括本领域其他荧光PCR试剂盒的必要成分，如PCR缓冲液，HotStartTaq酶和UNG酶。所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：(1)提取检测样本中的RNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织或胸腔液；(2)将提取的RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增反应；(3)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：检测反应体系的FAM和VIC/HEX荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准。若样本的质控体系Ct值≤30，则样本质量较好，可以进行下面的结果判读：如果3’端Ct值≥38：阴性；如果3’端Ct值<38：若5’端有Ct值，根据ΔCt1值(Ct值5’-Ct值3’)计算，ΔCt1值≥3，阳性，ΔCt1值<3，阴性；若5’端无Ct值，根据ΔCt2值(Ct值3’-Ct值质控)计算，ΔCt2<10，阳性，ΔCt2≥10，阴性。表1ALK基因表达差异的结果判读方法其中，PCR扩增反应的反应体系如下：RNA逆转录为cDNA的方法涉及反转录体系以及如下操作步骤：反转录体系包括如下成分：逆转录混合液(含逆转录酶)2μLRNA3μL加DNase/RNase-freeddH2O10μL。操作步骤为：a)将逆转录反应混合液混匀，置于冰上，取2μL逆转录反应混合液加入无菌无酶的离心管中，混匀。b)加入待测样品RNA3μL，RNA总量在0.1～5μg范围内，补水至10μL。c)37℃保温15分钟。d)85℃保温5秒后冰上冷却，得到cDNA模板。本专利技术涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。本专利技术的有益效果在于：本专利技术开发一种快速、廉价、操作简便、结果判读简单的ALK基因差异表达检测试剂盒及检测方法。本专利技术基于Taqman探本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测人类ALK基因表达的引物组合，其特征在于，包括SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:8所示的序列。

【技术特征摘要】
1.用于检测人类ALK基因表达的引物组合，其特征在于，包括SEQIDNO:1-SEQIDNO:8所示的序列。2.与权利要求1所述引物组合配合使用的特异性探针，其特征在于，其序列如SEQIDNO:9-SEQIDNO:12所示，其5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。3.用于检测人类ALK基因表达的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的特异性探针。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，含有质控系统，所述质控系统包含质控引物和质控探针，质控引物的序列如SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示，所述质控探针的序列如SEQIDNO:15所示。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述质控探针的5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有3种质粒DNA混合液，所述3种质粒DNA分别含有ALK基因外显子13-外显子15序列、ALK基因外显子25-外显子27序列，以及B2M基...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡从利，张喆，李丽琼，周鹏飞，
申请(专利权)人：武汉友芝友医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42