EML4‑ALK融合基因突变的检测引物、探针及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物技术及医学领域，具体公开了EML4‑ALK融合基因突变的检测引物、探针及检测试剂盒，用于EML4‑ALK融合基因突变的检测。所述检测引物包括SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:14所示的序列，所述探针序列如SEQ ID NO:15所示，其5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ‑MGB。所述试剂盒含有上述检测引物与探针以及质控系统等。本发明专利技术可特异性识别13种EML4‑ALK融合突变类型，且灵敏度高，可以检出5拷贝的突变，整个逆转录PCR及荧光PCR检测过程只需要80分钟即可完成。

EML4 ALK fusion gene mutation detection primer, probe and kit

The present invention relates to biological technology and medicine field, in particular discloses EML4 ALK fusion gene mutation detection primer, probe and kit for detecting EML4 gene mutations ALK fusion. The primer sequences of SEQ ID including NO:1 SEQ ID NO:14 shows, the probe sequence of SEQ ID NO:15 shows, the 5 'end modified with FAM or VIC, 3' NFQ modified MGB. The reagent box contains the detection primer and probe and the quality control system and the like. The invention can specifically identify 13 kinds of EML4 ALK fusion mutation type, and high sensitivity, can detect mutations in 5 copies, the reverse transcription PCR and fluorescence PCR detection process only needs 80 minutes to complete.

【技术实现步骤摘要】
EML4-ALK融合基因突变的检测引物、探针及检测试剂盒
本专利技术涉及生物技术及医学领域，具体地说，涉及EML4-ALK融合基因突变的检测。
技术介绍
肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其5年生存率仅为16.8％。根据世界卫生组织(WHO)癌症Globocan数据库，2012年我国新发肺癌患者达65.28万，居所有恶性肿瘤之首，约占全球1/3。基于组织病理学结果，肺癌可以划分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中80％为NSCLC。多数(>70％)肺癌患者在确诊时已处晚期，全身化疗是主要治疗选择。近年来，随着分子医学的进展和靶向药物的不断涌现，非小细胞肺癌的治疗已进入到个体化分子靶向"精准"治疗的时代。间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因型肺癌已成为继表皮生长因子(EGFR)突变型肺癌之后的又一个肺癌分子亚型，具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物。肺癌中ALK变异主要为ALK基因与其他基因发生断裂重排。其中，棘皮动物微管结合样蛋白4(EML4)-ALK融合基因变异是其主要类型。国内外大量的研究数据显示，发生ALK重排的非小细胞肺癌患者占3％～7％。EML4和ALK两个基因分别位于人类2号染色体的p21和P23带，相隔约12Mb。EML4与微管形成密切相关，ALK在肿瘤细胞信号转导起着重要的调节作用。这两个基因片段的倒位融合[inv(2)(p21p23)]可以让组织表达新的EML4-ALK融合蛋白,形成非配体依赖性二聚体引起组成性的ALK激活。ALK信号可通过激活RAS-MEK-ERK，JAK3-STAT3和PI3K-AKT信号通路导致细胞增殖和生成。克唑替尼是一种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂，既可特异性靶向抑制ALK，也可抑制c-MET和ROS1等信号通路。克唑替尼分别于2011年和2013年被美国食品与药品管理局(FDA)和中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准上市，用于治疗EML4-ALK表达的局部晚期或转移性NSCLC患者。临床试验显示对于ALK阳性的晚期非小细胞肺癌患者，克唑替尼的疗效显著优于传统化疗，一线单药治疗患者的中位无进展生存期(PFS)为10.9个月，有效率高达74％，二线单药治疗患者的中位PFS为7.7个月，有效率达到65.3％。2012年，据美国国家综合癌症网(NCCN)NSCLC临床指南推荐，晚期NSCLC患者开始治疗前应进行EML4-ALK检测，并建议阳性患者首先接受克唑替尼治疗。大约40％的ALK阳性NSCLC患者对克唑替尼原发耐药。新一代ALK抑制剂色瑞替尼的I期临床研究结果显示其对克唑替尼耐药及存在中枢神经系统转移病灶的患者具有较好的疗效。基于以上令人鼓舞的试验数据，2014年4月，FDA批准色瑞替尼用于治疗ALK阳性、经克唑替尼治疗疾病进展或不能耐受的转移性NSCLC患者。Alectinib是一种强效选择性ALK抑制剂，其Ⅱ期临床研究结果显示，46例ALK阳性未经克唑替尼治疗患者的ORR为93.5％。2014年7月Aectinib在日本获批使用。目前针对ALK融合基因检测的常用方法有荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学法(IHC)和荧光PCR方法。FISH价格昂贵，操作规范要求较高，且不能区分ALK融合类型(fusionvariants)；IHC简便易行，但阳性标准不统一，也不能区分ALK融合类型。CN102719525A公开了用于检测EML4-ALK融合基因突变的引物、探针及检测试剂盒，利用荧光PCR技术可以一次同时检测EML4与ALK基因的9种融合突变。随着时间推移，新的EML4与ALK基因的融合突变类型逐渐被发现，CN102719525A检测的9种EML4-ALK融合突变已经不能满足临床需求。且其公开的方法中荧光PCR检测需要90分钟，逆转录PCR另需要65分钟，整个步骤所需时间较长。同时为保证临床试验室检测结果的准确性，最好在产品中加入防污染体系，同时引入空白对照，对检测试剂及环境进行监测，防止假阳性结果的产生，这一方面CN102719525A中未有提及。因此需要有新的EML4-ALK检测方法来满足以下要求：1)能涵盖更多EML4-ALK融合突变类型；2)能节约检测时间；3)体系设计中增加防污染体系及空白对照，防止假阳性结果的产生，保证检测结果的准确可靠。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供EML4-ALK融合基因突变的检测引物、探针及检测试剂盒。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供了用于检测EML4-ALK基因融合突变的引物组合，包括SEQIDNO:1-SEQIDNO:14所示的序列。该引物组合可以特异性识别13种EML4-ALK融合突变类型。不仅如此，本专利技术还提供了与所述引物组合配合使用的特异性探针，其序列如SEQIDNO:15所示，其5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。第二方面，本专利技术提供了用于检测EML4-ALK基因融合突变的试剂盒，其含有前述的引物组合与特异性探针。为了提高所述试剂盒的检测准确度，所述试剂盒还含有质控系统，阳性对照液和空白对照液。所述质控系统包含质控引物和质控探针，质控引物的序列如SEQIDNO:16和SEQIDNO:17所示，所述质控探针的序列如SEQIDNO:18所示，所述质控探针的5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。所述阳性对照液为含有4种质粒DNA的混合液，所述4种质粒DNA分别含有EML4-ALK-M1、EML4-ALK-M5、EML4-ALK-M7和B2M序列，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。进一步地，所述试剂盒还包括本领域其他荧光PCR试剂盒的必要成分，如PCR缓冲液，HotStartTaq酶和UNG酶。所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：(1)提取检测样本中的RNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织或胸腔液；(2)将提取的RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增反应；(3)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：检测反应体系的FAM和VIC/HEX荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于等于38：阴性；Ct值小于38：阳性。其中，PCR扩增反应的反应体系如下：RNA逆转录为cDNA的方法涉及反转录体系以及如下操作步骤：反转录体系包括如下成分：逆转录混合液(含逆转录酶)2μLRNA3μL加DNase/RNase-freeddH2O10μL。操作步骤为：a)将逆转录反应混合液混匀，置于冰上，取2μL逆转录反应混合液加入无菌无酶的离心管中，混匀。b)加入待测样品RNA3μL，RNA总量在0.1～5μg范围内，补水至10μL。c)37℃保温15分钟。d)85℃保温5秒后冰上冷却，得到cDNA模板。本专利技术涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。本专利技术的有益效果在于：本专利技术采用ARMS引物特异性识别13种EML4-ALK融合突变类型，基于Taqman探针法收集荧光信号，特异性得到很好保障。本专利技术的试剂盒具有以下优点：(1)建立了实时荧光PCR体系，可同时检测EML4-本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测EML4‑ALK基因融合突变的引物组合，其特征在于，包括SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:14所示的序列。

【技术特征摘要】
1.用于检测EML4-ALK基因融合突变的引物组合，其特征在于，包括SEQIDNO:1-SEQIDNO:14所示的序列。2.与权利要求1所述引物组合配合使用的特异性探针，其特征在于，其序列如SEQIDNO:15所示，其5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。3.用于检测EML4-ALK基因融合突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的特异性探针。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，含有质控系统，所述质控系统包含质控引物和质控探针，质控引物的序列如SEQIDNO:16和SEQIDNO:17所示，所述质控探针的序列如SEQIDNO:18所示。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述质控探针的5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有阳性对照液和空白...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡从利，张喆，李丽琼，周鹏飞，
申请(专利权)人：武汉友芝友医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42