一种黄颡四锚虫的PCR检测引物、荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法技术

一种黄颡四锚虫的PCR检测引物、荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。提供了一对黄颡四锚虫18s可变区基因荧光定量PCR检测的专用引物，包含该引物的试剂盒及其检测方法。所述引物包括上游引物18s‑Ⅱ‑F和下游引物18s‑Ⅱ‑R，18s‑Ⅱ‑F的序列为：5’‑CTGGTCATGGCTCTGCTGAC‑3’，18s‑Ⅱ‑R的序列为：5’‑CGTTAAAGGAGCATCAGCTG‑3’。本发明专利技术首次提供了黄颡四锚虫18s基因荧光定量PCR检测中的专用引物，使利用荧光定量PCR对待测样本中18s可变区基因检测成为可能。

A Huangsang four anchor worm PCR detection primer and fluorescent quantitative PCR detection kit and detection method

A Huangsang four anchor worm PCR detection primer and fluorescent quantitative PCR detection kit and detection method. Provides a special primer of gene Huangsang four anchor worm 18S variable fluorescence quantitative PCR detection kit, containing the primer and its detection method. The primers include upstream primer 18S II F and primer 18S II R, 18S II F sequence: 5 \CTGGTCATGGCTCTGCTGAC 3\, sequence 18S R II: 5 \CGTTAAAGGAGCATCAGCTG 3\. The present invention provides the first special primer Huangsang four anchor worm 18S gene fluorescence quantitative PCR detection, so using fluorescence quantitative PCR to test the 18S gene of variable region samples become possible.

【技术实现步骤摘要】
一种黄颡四锚虫的PCR检测引物、荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及鱼类寄生虫检测领域，具体涉及一种黄颡四锚虫的PCR检测引物、荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
寄生于黄颡鱼鳃上的黄颡四锚虫(BychowskyellapseudobagriAchmerov)分布很广，东北、山东、浙江、湖北、广东、江苏、福建、云南、四川等均有记录，而且宿主亦广泛，它可寄生于多种黄颡属鱼类及鳠属(Hemibagrus)鱼类鳃上。小型虫体，体长0.210-0.588mm，体宽0.060-0.168mm。属于一种单殖吸虫，寄生于鱼类鳃部时表现出明显的“群居”现象，少量寄生黄颡四锚虫时，养殖鱼类并没有明显症状，多表现为吃食量下降或暗浮头现象。大量寄生时，病鱼呼吸困难，游动缓慢，鳃部明显浮肿，鳃盖张开，鳃上粘液增多，鳃丝肿胀或粘连，严重时发生变性或坏死，鳃因贫血而呈现苍白色或花鳃状。黄颡四锚虫流行与春末夏初，对鱼苗和鱼种的危害较大，大量寄生虫常引起苗种的大批死亡。寄生于大规格鱼种或成鱼时常引起养殖鱼类继发细菌寄生而产生大量死亡。黄颡四锚虫由于体型小，小量寄生时无症状，因此传统的检测方法，并不适合该寄生虫。而在检测和诊断技术中，荧光定量聚合酶链反应(Real-timeFluorescentQuantitativePolymeraseChainReaction,RtFQ-PCR)因其具有的简便、快速、敏感、特异、适于早期和大量样品检测的优点，已在该研究领域得到广泛应用。目前对于黄颡四锚虫的检测国内尚没有荧光定量PCR检测技术方面的研究报告。为了及时控制鱼病发生，迫切需要一种能快速检测鱼鳃内或环境水体中是否存在寄生虫的技术。
技术实现思路
本专利技术针对以上问题，提供了一对黄颡四锚虫18s可变区基因荧光定量PCR检测的专用引物，包含该引物的试剂盒及其检测方法。本专利技术的技术方案是：一种黄颡四锚虫的PCR检测引物，所述引物包括上游引物18s-Ⅱ-F和下游引物18s-Ⅱ-R，18s-Ⅱ-F的序列为：5’-CTGGTCATGGCTCTGCTGAC-3’，18s-Ⅱ-R的序列为：5’-CGTTAAAGGAGCATCAGCTG-3’。所述上游引物18s-Ⅱ-F和下游引物18s-Ⅱ-R的摩尔浓度比是1：1。一种黄颡四锚虫的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组分：其中，上游引物为18s-Ⅱ-F，序列为：5’-CTGGTCATGGCTCTGCTGAC-3’，下游引物为18s-Ⅱ-R，序列为：5’-CGTTAAAGGAGCATCAGCTG-3’。还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括7.5×107拷贝/μL的强阳性对照和469拷贝/μL的临界阳性对照质粒；所述阴性对照为无菌水。所述阳性对照的核苷酸序列是：CTGGTCATGGCTCTGCTGACTTGTCAGTGGGGAAATGGCTAGCTGGTATATTCACTCATAGCTTCGCAGCTGTGTCCATGTGTCCTCGGACGTATGGATGGCGTTGGGTGTCAGCTGATGCTCCTTTAACG。所述阳性对照质粒的构建方法包括如下步骤：1)、制备黄颡四锚虫的DNA模板：将形态鉴定好的黄颡四锚虫置于1.5mL的EP管中，加入180μL组织裂解液TL，20mg/ml的蛋白酶K20μL，于55℃水浴3h或者直到消化完全；加入200μL结合液CB和100μL异丙醇，13000rpm离心5min，将上清加入一个吸附柱AC中，13000rpm离心30-60s；加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30s；加入600μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，并重复该步骤一次；取出吸附柱AC，放入干净的离心管中，加入100μL无菌水，室温放置3-5min，12000rpm离心1min，并将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，得到黄颡四锚虫DNA模板，在-20℃保藏备用；2)、PCR体系扩增：PCR体系为：黄颡四锚虫DNA模板5μL10pmol/μL的上游引物18s-Ⅱ-F2.0μL，10pmol/μL的下游引物18s-Ⅱ-R2.0μL，5UTaqDNA聚合酶0.6μL，2×进口实时荧光PCR缓冲液12.5μL，DEPC水补充至25μL；PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，75℃5s,读板共40个循环；3)、将步骤2)得到的黄颡四锚虫的目的片段用2％琼脂糖凝胶电泳分离得到靶标条带，用干净的手术刀切下包含靶标条带的凝胶，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收靶标DNA；4)、将回收的DNA在16℃下加入到连接体系中，并于16℃下放置10h；5)、将步骤4)得到的连接产物转化到制备好的大肠杆菌感受态，并涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，37℃培养至长出菌落；6)、挑取菌落并制备成菌悬液，使用载体通用引物及菌落PCR验证并挑选阳性克隆子；7)、将阳性克隆子对应的细菌于LB液体培养基中，37℃下200rpm摇菌培养10h，并取1mL用质粒小提试剂盒提取质粒DNA，从而得到阳性对照质粒，测定提取的阳性对照质粒DNA的浓度，稀释后作为阳性对照用于PCR检测。一种黄颡四锚虫的检测方法，使用上述的试剂盒进行检测，包括如下步骤：1)、制备DNA模板：取样品一小块鳃组织块，加入200μLMilliporeH2O，捣烂，取出没有捣烂的组织块，剩余浑浊液12000rpm离心1min，弃上清，加入200μLMilliporeH2O重悬，充分混匀后取50μL加入到200μL6％的chelex-100中，混匀，56℃保温20min，剧烈震荡混匀后于100℃保温8min，剧烈震荡，并于12000rpm离心3min，取上清作为PCR的模板；2)、实时荧光定量PCR扩增：配置PCR反应体系，每25μL的PCR反应体系具体包括：其中，12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液包括2.5μL的10×buffer、2μL的10mMdNTP、0.0025μL的10000×SYBRgreenI以及8μLDEPC水。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，读板共40个循环；3)、结果判断：观察实时荧光定量PCR扩增曲线，若获得的荧光扩增曲线Ct值低于临界对照Ct值，则样品患有黄颡四锚虫病。本专利技术的有益效果是：1)首次提供了黄颡四锚虫18s基因荧光定量PCR检测中的专用引物，使利用荧光定量PCR对待测样本中18s可变区基因检测成为可能；2)本检测方法与黄颡四锚虫其他常规检测方法，如显微镜观察法和普通PCR相比，灵敏度和特异性极高，具有操作程序简单易用的特点，本试剂盒可用于操作程序化，适合大面积推广和应用，检测效率得到了很大的提高；3)本检测方法不仅能够评价鱼体的黄颡四锚虫寄生情况，同时也可用于水体中黄颡四锚虫的检测。本专利技术能为快速、准确地检测出黄颡四锚虫提供保证，为预防疾病，科学用药和保障鱼类健康提供了保障。依据本专利技术专用引物的检测方法及试剂盒可用于鱼类鳃及水体中黄颡四锚虫18s可变区基因的核苷酸检测。附图说明图1是采用三对引物分别对于黄颡四锚虫的目标靶基因进行扩增后的电泳图；图2是采本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄颡四锚虫的PCR检测引物，其特征在于，所述引物包括上游引物18s‑Ⅱ‑F和下游引物18s‑Ⅱ‑R，18s‑Ⅱ‑F的序列为：5’‑CTGGTCATGGCTCTGCTGAC‑3’，18s‑Ⅱ‑R的序列为：5’‑CGTTAAAGGAGCATCAGCTG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种黄颡四锚虫的PCR检测引物，其特征在于，所述引物包括上游引物18s-Ⅱ-F和下游引物18s-Ⅱ-R，18s-Ⅱ-F的序列为：5’-CTGGTCATGGCTCTGCTGAC-3’，18s-Ⅱ-R的序列为：5’-CGTTAAAGGAGCATCAGCTG-3’。2.根据权利要求1所述的一种黄颡四锚虫的PCR检测引物，其特征在于，所述上游引物18s-Ⅱ-F和下游引物18s-Ⅱ-R的摩尔浓度比是1：1。3.一种黄颡四锚虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：其中，上游引物为18s-Ⅱ-F，序列为：5’-CTGGTCATGGCTCTGCTGAC-3’，下游引物为18s-Ⅱ-R，序列为：5’-CGTTAAAGGAGCATCAGCTG-3’。4.根据权利要求3所述的一种黄颡四锚虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括7.5×107拷贝/μL的强阳性对照和469拷贝/μL的临界阳性对照质粒；所述阴性对照为无菌水。5.根据权利要求4所述的一种黄颡四锚虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照的核苷酸序列是：CTGGTCATGGCTCTGCTGACTTGTCAGTGGGGAAATGGCTAGCTGGTATATTCACTCATAGCTTCGCAGCTGTGTCCATGTGTCCTCGGACGTATGGATGGCGTTGGGTGTCAGCTGATGCTCCTTTAACG。6.根据权利要求4所述的一种黄颡四锚虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照质粒的构建方法包括如下步骤：1)、制备黄颡四锚虫的DNA模板：将形态鉴定好的黄颡四锚虫置于1.5mL的EP管中，加入180μL组织裂解液TL，20mg/ml的蛋白酶K20μL，于55℃水浴3h或者直到消化完全；加入200μL结合液CB和100μL异丙醇，13000rpm离心5min，将上清加入一个吸附柱AC中，13000rpm离心30-60s；加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30s；加入600μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，并重复该步骤一次；取出吸附柱AC，放入干净的离心管中，加入100μL无菌水，室温放置3-5min，12000rpm离心1min，并将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，得到黄颡四锚虫DNA模板，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张秧兆，张东，王桂堂，张露，邹红，
申请(专利权)人：扬州宏盛水产科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32