转基因大豆事件GC1-1外源插入片段旁侧序列及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物生物技术领域，公开了一种高产转基因大豆事件GC1‑1外源插入片段旁侧序列及其应用。本发明专利技术提供的高产转基因大豆事件GC1‑1经鉴定至少有一个插入位点，这个插入位点的外源插入片段3’端旁侧序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术提供了用于检测该旁侧序列的引物，如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。本发明专利技术的高产转基因大豆GC1‑1外源插入片段旁侧序列的鉴定适用于对高产转基因大豆GC1‑1(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其制品)的检测。

Flanking sequence and its application into the event GC1 1 exogenous transgenic soybean

The invention belongs to the field of plant biotechnology, discloses a high-yield transgenic soybean event GC1 flanking sequence and its application into the 1 exogenous. The invention provides a high yield of transgenic soybean event GC1 1 identified at least one insertion site, the insertion site of the inserted fragment 3 'flanking sequences such as SEQ ID No.1 shown. The present invention provides for the detection of the primers flanking sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID and SEQ No.2 ID is shown in No.3. Identification of flanking sequence inserted into the invention of high yield of transgenic soybean GC1 1 exogenous suitable for high yield of transgenic soybean GC1 1 (including parents, F1 and hybrid offspring) and its products (including plants, seeds, and tissue products) detection.

【技术实现步骤摘要】
转基因大豆事件GC1-1外源插入片段旁侧序列及其应用
本专利技术涉及植物生物
，具体地，涉及一种转基因大豆GC1-1外源插入片段旁侧序列以及用于检测该序列的PCR引物，本专利技术还涉及利用该引物进行转基因大豆检测的方法和试剂盒。
技术介绍
作物高产途径不外乎培育高产品种、施加有机肥和增产剂以及改善栽培耕作方式等。培育高产品种的手段有传统的杂交育种和现代的分子育种(包括转基因育种)。转基因育种是在对目标基因的功能及作用机制有较明确认识的前提下进行的，因而周期较短、增产效率较高。在大豆中也有很多通过转基因技术提高大豆产量和抗性的报道。如过表达Ncl基因(Na+、K+和Cl-转运蛋白)的大豆具有较高的耐盐性，在高盐地区的产量比野生型提高3.6～5.5倍(Doetal.,2016)；LOS5/ABA3(脱落酸醛脱氢氧化酶活性相关基因)转基因大豆在干旱条件下气孔开放大小及蒸腾速率降低，抗旱性明显增强，在干旱条件下的产量比野生型约提高21％(Lietal.,2013)；在美国和阿根廷等国家的实验表明，在大豆中过表达向日葵Hahb-4(乙烯信号转导途径基因)，能延缓大豆衰老，在干旱等逆境下产量提高7-15％(Waltzetal.,2014)；孟山都公司报道，在大豆中过表达拟南芥的BBX32开花基因，产量增加5-7％(Preussetal.,2016)；过表达蓝细菌FBP/SBPase(Bifunctionalfructose-1,6/sedoheptulose-1,7-bisphosphatase)基因的大豆，在高CO2浓度、高温等逆境(即：未来潜在的环境条件)下保持稳产(Kohleretal.,2016)；下调大豆BS1(BigSeed1)同源基因的表达，显著增加大豆种子大小，干重增加45％以上(Geetal.,2016)。APETALA2-like基因GmTOE4a的过表达转基因大豆具有株高及节间缩短、茎杆粗壮等高产潜质的农艺性状(Zhaoetal.,2015)。作物的花期及生育期与其产量密切相关，国内外已有多篇文献报道，在水稻、番茄等农作物中，利用转基因手段改变花期相关基因的表达水平可提高其产量。Gao等通过图位克隆揭示DTH7编码一个apseudo-responseregulator蛋白，其表达受到光周期调控。在长日条件下DTH7抑制Ehd1从而来延迟开花。作者进一步发现DTH7与Ghd7和DTH8的不同单倍型组合能够在不同的光周期环境中与水稻抽穗期和谷粒产量成显著的相关性。但目前尚未有报道利用花期相关基因培育高产大豆的研究成果。FT蛋白或(和)mRNA是成花素的重要组分。在拟南芥中，FT是一个开花途径整合因子，特异在长日条件下起开花促进作用(Kardailskyetal.，1999；Kobayashietal.，1999)。Hd3a是水稻中FT的同源基因，主要在短日条件下起开花促进作用。不同植物如水稻、番茄、南瓜、矮牵牛、杨树和葡萄的FT同源基因在拟南芥中组成型表达后，都能在非诱导型光周期条件下促进拟南芥开花(Hsuetal.，2006；LifschitzandEshed，2006；Carmonaetal.，2007；Hayamaetal.，2007；Linetal.，2007)。申请人将克隆到的大豆FT同源基因GmFTL1/2/3/4/5/6在拟南芥中过表达，同样也能促进拟南芥开花(Fanetal.,2014)。在木本植物杨树中FT同源基因的组成型表达显著地缩短童期并促进了成花转变(Hsuetal.，2006)。这些研究结果表明不同植物来源的FT序列和功能高度保守，都具有抑制营养生长促进植物开花的功能。申请人将含有大豆花期基因RNAi片段的表达载体通过农杆菌介导法转入到大豆基因组中，获得了一个高产转基因大豆事件GC1-1并正在进行中间试验阶段的安全评价。对转基因大豆进行转化事件特异性检测，能更好的对转基因大豆进行监督管理。而外源插入片段的旁侧序列和依据此旁侧序列建立的检测方法，是进行监督管理的一个重要指标。因此需要获得转基因大豆GC1-1的旁侧序列，并建立鉴定体系以备对此事件的监督管理。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种转基因大豆事件GC1-1外源插入片段旁侧序列及其应用。本专利技术另一目的在于提供一种转基因大豆的PCR检测方法和试剂盒。本专利技术的高产转基因大豆事件GC1-1按如下方式获得：以大豆GmFTL1的cDNA为模板，克隆得到273bp的核苷酸片段，通过TA克隆连接到克隆载体pGWCm，连接到克隆载体上的片段再经过LR反应重组至RNA干涉表达载体pB7GWIWG2(I)。该片段转录得到的RNA分子能够抑制大豆FT家族6个基因的表达。将构建好的载体pB7GWIWG2-FTL-RNAi通过冻融法转入农杆菌EHA105中。通过农杆菌介导的大豆子叶节转化法将载体转化至大豆天隆1号。对获得的转基因植株进行草铵膦涂抹及PCR鉴定得到高产转基因大豆GC1-1。通过在温室及中间试验的田间调查结果显示，转基因大豆GC1-1与天隆1号相比花期延迟5-7天，单株产量增幅在30％以上，达到极显著水平。本专利技术提供了高产转基因大豆事件GC1-1插入位点的外源插入片段的3’端旁侧序列，其含有SEQIDNO.1所示的序列或其特异性片段。本专利技术提供了SEQIDNO.1所示的旁侧序列在检测转基因大豆中的应用。特定的转基因事件其旁侧序列是特定的，因此，应用旁侧序列可以特异地检测转基因事件。可设计用于特异性扩增包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的引物，进行PCR扩增，检测特异条带。可以根据在5’旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源插入片段设计下游特异性引物，扩增特异性片段；或可以根据外源插入片段设计上游特异性引物，根据3’旁侧序列设计下游特异性引物，扩增特异性片段。本专利技术还提供了用于扩增含有SEQIDNO.1所示序列的特异性引物。在本专利技术的一个实施例中，提取高产转基因大豆GC1-1叶片基因组DNA，利用特异性引物和随机引物进行TAIL-PCR反应，获得外源基因在大豆基因组整合位点的右边界长约4kb的序列，包括第1-546bp共546bp的载体序列和约3.5kb的大豆基因组序列。分析外源片段整合位点的右边界序列，根据大豆基因组序列信息分别设计特异性下游引物RP:5’-CTGCTGAAATTGAGTTTGGAGC-3’(SEQIDNo.2)，根据载体pB7GWIWG2(I)中T-DNA区3’端RB序列设计上游鉴定引物RB3:5’-GACTCTGTATGAACTGTTCGCCAG-3’(SEQIDNo.3)。通过普通PCR扩增可得到935bp特异性片段(SEQIDNo.1)，包括第1-546共546bp的载体序列和第547-935共389bp的大豆基因组序列。本专利技术提供了上述引物在制备检测转基因大豆试剂盒中的应用。本专利技术提供了一种检测转基因大豆事件GC1-1的方法，其是以样品总DNA为模板，利用本专利技术提供的引物进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果。上述检测转基因大豆事件GC1-1的方法，20μLPCR反应体系为：10×PCR缓冲液2.0μL，10mmol/LdNTP1.0μL，5U/μl的taq酶0.3μL，大豆本文档来自技高网...

【技术保护点】
高产转基因大豆事件(Glycine max)GC1‑1插入位点的外源插入片段的3’端旁侧序列，其含有SEQ ID NO.1所示的序列或其特异性片段。

【技术特征摘要】
1.高产转基因大豆事件(Glycinemax)GC1-1插入位点的外源插入片段的3’端旁侧序列，其含有SEQIDNO.1所示的序列或其特异性片段。2.权利要求1所述的3’端旁侧序列在检测转基因大豆中的应用。3.用于检测权利要求1所述3’端旁侧序列的特异性引物。4.如权利要求3所述的特异性引物，其核苷酸序列为：RB3:5’-GACTCTGTATGAACTGTTCGCCAG-3’RP:5’-CTGCTGAAATTGAGTTTGGAGC-3’。5.权利要求3或4所述的特异性引物在制备检测转基因大豆试剂盒中的应用。6.一种检测转基因大豆事件GC1-1的方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，以含有SEQIDNO.1所示的序列或其特异性片段为靶序列，设计特异性引...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅永福，张晓玫，陈福禄，徐坤，朱金龙，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11