基于CRISPR-Cas9体外改造腺病毒载体的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR‑Cas9体外改造腺病毒载体的方法。本发明专利技术还提供了适于改造大质粒载体的分子克隆方法，包括如下：根据出发质粒的待改造位点设计合适的sgRNA，采用Cas9蛋白和sgRNA体外切割所述出发质粒，再基于同源重组的方法将被切割的出发质粒与目的基因相连接，从而完成改造。本发明专利技术所提供的方法有效的解决了大质粒载体用常规的分子生物学手段很难找到合适的限制性酶切位点对其进行改造的问题。该方法是点突变试剂盒的改进，点突变试剂盒一般就包括对目的蛋白进行点突变、构建结构域缺失的截短体等，本发明专利技术有效解决了点突变试剂盒对超过10kb的大载体进行突变时容易引起二次突变(由于PCR酶保真性引起的随机突变)的技术难点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，涉及一种基于CRICPR-Cas9体外改造腺病毒载体的方法，特别涉及一种基于CRICPR-Cas9体外改造5型腺病毒纤毛基因的方法。
技术介绍
5型腺病毒(Adenovirustype5，Ad5)是目前应用于各种重大疾病临床前治疗和临床治疗研究的主要运载工具。腺病毒的纤毛由尾巴、杆、头节3部分组成，在感染细胞过程中发挥重要的作用，腺病毒感染细胞的过程开始于纤毛的头节结合细胞表面的特异性受体，不同血清型的腺病毒所识别的细胞表面受体存在较大差异(NicklinSA,WuE,NemerowGR,etal.Theinfluenceofadenovirusfiberstructureandfunctiononvectordevelopmentforgenetherapy[J].MolTher.2005,12(3):384-393.)。通过将5型腺病毒中编码纤毛头节和杆区的基因与其他血清型腺病毒纤毛头节和杆区编码基因进行替换重组，形成嵌合型腺病毒载体，能够显著提高病毒感染特定类型细胞的效率。比如35型腺病毒结合细胞的天然受体是CD46，该分子在T淋巴细胞中有较高水平表达。Ad5F35嵌合型腺病毒能在保留Ad5的所有特性基础上显著提高感染T淋巴细胞的效率(SchroersR,HildebrandtY,HasenkampJ,etal.GenetransferintohumanTlymphocytesandnaturalkillercellsbyAd5/F35chimericadenoviralvectors[J].ExpHematol.2004,32(6):536-546.)。Ad5F11嵌合型腺病毒则能显著提高感染细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells，CIK)的效率(StecherH,ShayakhmetovDM,StamatoyannopoulosG,etal.Acapsid-modifiedadenovirusvectordevoidofallviralgenes:assessmentoftransductionandtoxicityinhumanhematopoieticcells[J].MolTher.2001,4(1):36-44.)。然而腺病毒载体其基因组全长36Kb，用常规的分子生物学手段很难找到合适的限制性酶切位点对其进行改造。规律成簇间隔短回文重复系统(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成DNA双链断裂(Double-strandbreaks，DSB)。这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，已被广泛用于细胞水平、动物水平研究。理论上Cas9蛋白在sgRNA(singleguideRNA)的引导下可以切割任何存在NGG(以及NAG)间隔相邻基序(protospaceradjacentmotif，PAM)的上游DNA。目前，尚未有基于CRICPR-Cas9基因编辑技术体外改造5型腺病毒载体制备Ad5F35嵌合型腺病毒的方法。
技术实现思路
为了解决大质粒载体用常规的分子生物学手段很难找到合适的限制性酶切位点对其进行改造的问题，以及点突变试剂盒对超过10kb的大载体进行突变时容易引起二次突变(由于PCR酶保真性引起的随机突变)的技术难点，本专利技术提供一种适用于大质粒载体改造的分子克隆方法。本专利技术所提供的分子克隆方法，具体可为如下三种中的任一种：第一种：将出发质粒的靶标基因替换为目的基因得到重组环形质粒的方法，具体可包括如下步骤：(a)以所述出发质粒上所述靶标基因的起始区域中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列1；以所述出发质粒上所述靶标基因的终止区域中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列2；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数(如X为18或20)，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；针对所述靶序列1设计合成双链DNA1，所述双链DNA1中的一条链与所述靶序列1反向互补；针对所述靶序列2设计合成双链DNA2，所述双链DNA2中的一条链与所述靶序列2反向互补；(b)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得特异于所述靶序列1的向导RNA1和特异于所述靶序列2的向导RNA2；(c)采用Cas9蛋白、所述向导RNA1和所述向导RNA2切割所述出发质粒，获得切除了所述靶标基因的所述出发质粒的骨架片段；(d)根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述出发质粒的骨架片段的上下游末端部分的序列，设计并合成自5’端到3’端依次为上游同源臂、所述目的基因、下游同源臂的DNA片段；所述上游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的3’端序列相同；所述下游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的5’端序列相同；(e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段与所述出发质粒的骨架片段进行同源重组，完成所述目的基因与所述出发质粒的骨架片段的连接，即获得将所述出发质粒的所述靶标基因替换为所述目的基因的重组环形质粒。第二种：在出发质粒的靶标片段中插入目的基因得到重组环形质粒的方法，具体可包括如下步骤：(a)以所述出发质粒上所述靶标片段中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数(如X为18或20)，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；针对所述靶序列设计合成双链DNA，所述双链DNA中的一条链与所述靶序列反向互补；(b)将所述双链DNA构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得特异于所述靶序列的向导RNA；(c)采用Cas9蛋白和所述向导RNA切割所述出发质粒，获得在所述靶标片段中被切开的线性出发质粒；(d)根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述线性出发质粒的上下游末端部分的序列，设计并合成自5’端到3’端依次为上游同源臂、所述目的基因、下游同源臂的DNA片段；所述上游同源臂的序列与所述线性出发质粒的3’端序列相...

【技术保护点】
分子克隆方法，为将出发质粒的靶标基因替换为目的基因得到重组环形质粒，其特征在于：所述方法为包括如下步骤：(a)以所述出发质粒上所述靶标基因的起始区域中符合5’‑NX‑NGG‑3’或5’‑CCN‑NX‑3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列1；以所述出发质粒上所述靶标基因的终止区域中符合5’‑NX‑NGG‑3’或5’‑CCN‑NX‑3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列2；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；针对所述靶序列1设计合成双链DNA1，所述双链DNA1中的一条链与所述靶序列1反向互补；针对所述靶序列2设计合成双链DNA2，所述双链DNA2中的一条链与所述靶序列2反向互补；(b)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得特异于所述靶序列1的向导RNA1和特异于所述靶序列2的向导RNA2；(c)采用Cas9蛋白、所述向导RNA1和所述向导RNA2切割所述出发质粒，获得切除了所述靶标基因的所述出发质粒的骨架片段；(d)根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述出发质粒的骨架片段的上下游末端部分的序列，设计并合成自5’端到3’端依次为上游同源臂、所述目的基因、下游同源臂的DNA片段；所述上游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的3’端序列相同；所述下游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的5’端序列相同；(e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段与所述出发质粒的骨架片段进行同源重组，完成所述目的基因与所述出发质粒的骨架片段的连接，即获得将所述出发质粒的所述靶标基因替换为所述目的基因的重组环形质粒。...

【技术特征摘要】
1.分子克隆方法，为将出发质粒的靶标基因替换为目的基因得到重组环形质粒，
其特征在于：所述方法为包括如下步骤：
(a)以所述出发质粒上所述靶标基因的起始区域中符合5’-NX-NGG-3’或
5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列1；以所述出发质粒
上所述靶标基因的终止区域中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序
列中的“NX”所示序列为靶序列2；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，
且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；
针对所述靶序列1设计合成双链DNA1，所述双链DNA1中的一条链与所述靶序
列1反向互补；针对所述靶序列2设计合成双链DNA2，所述双链DNA2中的一条链
与所述靶序列2反向互补；
(b)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体
中，经体外转录获得特异于所述靶序列1的向导RNA1和特异于所述靶序列2的向导
RNA2；
(c)采用Cas9蛋白、所述向导RNA1和所述向导RNA2切割所述出发质粒，获
得切除了所述靶标基因的所述出发质粒的骨架片段；
(d)根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述出发质粒的骨架片
段的上下游末端部分的序列，设计并合成自5’端到3’端依次为上游同源臂、所述目的
基因、下游同源臂的DNA片段；所述上游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段
的3’端序列相同；所述下游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的5’端序列相同；
(e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA
片段与所述出发质粒的骨架片段进行同源重组，完成所述目的基因与所述出发质粒的
骨架片段的连接，即获得将所述出发质粒的所述靶标基因替换为所述目的基因的重组
环形质粒。
2.分子克隆方法，为在出发质粒的靶标片段中插入目的基因得到重组环形质粒，
其特征在于：所述方法为包括如下步骤：
(a)以所述出发质粒上所述靶标片段中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列
排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，
14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；
针对所述靶序列设计合成双链DNA，所述双链DNA中的一条链与所述靶序列反
向互补；
(b)将所述双链DNA构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得特
异于所述靶序列的向导RNA；
(c)采用Cas9蛋白和所述向导RNA切割所述出发质粒，获得在所述靶标片段
中被切开的线性出发质粒；
(d)根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述线性出发质粒的上
下游末端部分的序列，设计并合成自5’端到3’端依次为上游同源臂、所述目的基因、
下游同源臂的DNA片段；所述上游同源臂的序列与所述线性出发质粒的3’端序列相
同；所述下游同源臂的序列与所述线性出发质粒的5’端序列相同；
(e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA
片段与所述线性出发质粒进行同源重组，完成所述目的基因与所述线性出发质粒的连
接，即获得在所述出发质粒的所述靶标片段中插入所述目的基因的重组环形质粒。
3.分子克隆方法，为将出发质粒的靶标基因缺失得到重组环形质粒，其特征在
于：所述方法为包括如下步骤：
(a)以所述出发质粒上所述靶标基因的起始区域中符合5’-NX-NGG-3’或
5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序列中的“NX”所示序列为靶序列1；以所述出发质粒
上所述靶标基因的终止区域中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的序
列中的“NX”所示序列为靶序列2；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，
且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；
针对所述靶序列1设计合成双链DNA1，所述双链DNA1中的一条链与所述靶序
列1反向互补；针对所述靶序列2设计合成双链DNA2，所述双链DNA2中的一条链
与所述靶序列2反向互补；
(b)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体
中，经体外转录获得特异于所述靶序列1的向导RNA1和特异于所述靶序列2的向导
RNA2；
(c)采...

【专利技术属性】
技术研发人员：张普民，唐立春，张卜兮，
申请(专利权)人：北京蛋白质组研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11