一种用于提取微量新鲜外周血有核细胞蛋白的方法及其专用装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种用于临床微量新鲜外周血制备PBMC蛋白的方法，该方法操作简单，且在血液起始量低的情况下蛋白回收率能达到后续分析要求。本方法实现了提取20μL～120μL新鲜外周血PBMC蛋白，较大程度上减少了所需临床新鲜外周血样本体积和病患负担。新鲜外周血样本体积和病患负担。

【技术实现步骤摘要】
一种用于提取微量新鲜外周血有核细胞蛋白的方法及其专用装置


[0001]本专利技术属于蛋白质组领域，具体涉及一种蛋白质组学微量样品制备方法，该方法操作简单快捷，在微量血液样品中外周血单核细胞蛋白组学制备方面有着优越的性能。

技术介绍

[0002]新鲜外周血由血清、血细胞和血小板等构成，其中血细胞又分为红细胞(RBC)和白细胞(WBC)。新鲜外周血单个核细胞(PBMC)是新鲜外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。红细胞和多核白细胞的比重在1.092左右，单个核细胞的比重为1.075
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1.090，血小板为1.030
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1.035。因此利用一种介于1.075
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1.092之间而近于等渗的溶液作密度梯度离心液，使不同的细胞按相应密度梯度在不同高度分布，红细胞与白细胞在最底层，密度梯度离心液在第二层，PBMC分布在第三层，血小板与血浆分布最上层。目前还没有提取微升血液中PBMC的方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的一个目的是提供一种蛋白质组学微量血液样品制备装置，我们将其命名为PBMC
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mCap。该装置制作方法简单快速，成本低廉，常规实验室、临床医学检验均可完成操作。本装置可用于微升级血液样本PBMC的提取，先用该装置提取PBMC，再提取蛋白并消化成肽段，最后可进行微克蛋白的蛋白质组学研究。该装置实现了微升级血液PBMC的高效俘获，减少了对临床病患新鲜外周血样本体积的需求。
[0004]本专利技术所提供的蛋白质组学微量血液样品制备装置，是以一封闭底部尖头的200μL的移液枪头(PBMC
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mCap)作为提取PBMC的分离容器，根据血中不同细胞密度不同的特点，先加入密度稍大于PBMC但小于WBC的密度梯度离心液(Lymphoprep
TM
淋巴细胞分离液)，离心时实现血液中血细胞的分层，使得PBMC能吸附在PBMC
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mCap上，从而满足微量样品制备PBMC的需求。
[0005]本专利技术还提供了上述蛋白质组学微量血液样品制备装置的制备方法。
[0006]本专利技术所提供的蛋白质组学微量血液样品制备装置的制备方法，包括以下步骤：
[0007](a)PBMC
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mCap制作：将200μL移液枪头尖头底部封闭，以制备细长的分离反应池PBMC
‑
mCap；
[0008](b)清洗PBMC
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mCap：待PBMC
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mCap封闭冷却后，使用乙腈清洗PBMC
‑
mCap；
[0009]上述方法步骤(a)中，封闭尖头底部的方法可使用酒精灯外焰迅速封闭移液枪枪头底部、或者使用其他能封闭移液枪头底部的方法，如直接生产封闭底部移液枪枪头和附有移液枪头盖等方式。
[0010]进一步的，PBMC
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mCap离心装置制作：在1.5mL离心管上加入一个适配器，再将PBMC
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mCap作为分离容器置于其适配器上方固定于1.5mL体积EP管中，以便于后续离心步骤。
[0011]本专利技术还提供了一种提取微量血液样品中外周血单个核细胞(PBMC)的方法。
[0012]本专利技术所提供的提取微量血液样品PBMC的方法，包括下述步骤：
[0013](1)在PBMC
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mCap中加入常温密度梯度离心液，分别将血液样品用PBS缓冲液体积比1：1稀释后小心的平铺于常温密度梯度离心液表面；
[0014](2)离心分离PBMC：加入血样后，用封口膜封闭PBMC
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mCap顶部后小心的置于离心机中，离心；
[0015](3)分离PBMC层：先用200μL Pipette Tip移液枪枪头移除上层血浆与血小板，再换个Pipette Tip移液枪枪头取PBMC层置于1.5mL离心管中；
[0016](4)裂红：在含PBMC的离心管中加入1mL红细胞裂解液，摇晃后，冰上静置后离心，裂解PBMC中残留的红细胞；
[0017](5)清洗PBMC：离心后用移液枪小心移除上清液体，再加入1mL PBS缓冲液离心，最后移除上清；
[0018](6)收集PBMC：在清洗后的PBMC中加入少量PBS缓冲液，再离心，移除所有上清，收集PBMC沉淀。
[0019]上述方法步骤(1)中，所述密度梯度离心液具体Lymphoprep
TM
淋巴细胞分离液。所述血液样品与所述密度梯度离心液的体积比为1：0.5
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2，具体如1:1。加入所述血液样品的体积可在20μL～120μL，加入血液样品和密度梯度离心液总体积小于300μL。
[0020]所述血液样品具体可为新鲜外周血，优选为取出体内24h的新鲜外周血。
[0021]上述方法步骤(2)中，所述离心的条件为：1180g离心10min。
[0022]上述方法步骤(4)中，所述红细胞裂解液为氯化铵红细胞裂解液(STEMCELL)。
[0023]上述方法步骤(4)中，加入红细胞裂解液后，不可反复剧烈摇晃PBMC混悬液，轻微摇晃后必须静置10min。所述离心的条件为：300g离心8min。
[0024]上述方法步骤(5)中，移液枪移除的表面液体根据离心后PBMC分布的高度决定，第一次移除上清液体不小于800μL，第二次移除上清不小于1ml。
[0025]上述方法步骤(5)中，移除所有上清时使用200μL的Pipette Tip移液枪枪头移除；所述200μL的Pipette Tip移液枪枪头不可碰到底部PBMC沉淀。
[0026]所述离心的条件为：300g离心8min。
[0027]上述方法步骤(6)中，所述PBS缓冲液的用量可为200μL。
[0028]所述离心的条件为：1200g离心5min。
[0029]本专利技术中所述PBS缓冲液的pH值均为7.3～7.5。
[0030]本方法原创性地封闭200μL移液枪枪头(Tip)尖头部分，先在Tip头中加入一定量的密度梯度离心液，再将微量新鲜外周血与等量PBS缓冲液混合均匀后，小心的平铺在密度梯度离心液表面，离心后PBMC层会大部分紧贴于Tip头壁上，一部分悬浮在贴壁PBMC旁边，形成PBMC层，再用Pipette Tip移液枪枪头取出PBMC层进行裂红、清洗和蛋白提取。基于血液中不同细胞成分的密度差异，可用密度梯度离心法分离，利用与PBMC密度稍大的密度梯度分离液将PBMC层从白细胞中分离纯化。
[0031]本方法利用Tip头体积小、形成微量反应池的特点，使微量PBMC能明显分层便于提取，最后加入50％三氟乙醇(TFE)，冰上水浴超声裂解蛋白。
[0032]本专利技术的有益效果在于：
[0033]1、本专利技术提供的装置大大降低了血液起始量，满足了临床上血液样本较少样本的蛋白质组学研究需求。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质组学微量血液样品制备装置，其特征在于：是以一封闭底部尖头的200μL的移液枪头作为提取PBMC的分离容器。2.权利要求1所述蛋白质组学微量血液样品制备装置的制备方法，包括以下步骤：(a)将200μL移液枪头尖头底部封闭，以制备细长的分离反应池PBMC
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mCap；(b)清洗PBMC
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mCap：待PBMC
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mCap封闭冷却后，使用乙腈清洗PBMC
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mCap，即得所述蛋白质组学微量血液样品制备装置。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(a)中，封闭尖头底部的方法包括使用酒精灯外焰迅速封闭移液枪枪头底部、或者使用其他能封闭移液枪头底部的方法，包括直接生产封闭底部移液枪枪头和附有移液枪头盖的方式。4.一种提取微量血液样品中外周血单个核细胞的方法，包括下述步骤：(1)在权利要求1所述的蛋白质组学微量血液样品制备装置中加入常温密度梯度离心液，分别将血液样品用PBS缓冲液体积比1：1稀释后平铺于所述常温密度梯度离心液表面；(2)离心分离PBMC：用封口膜封闭所述蛋白质组学微量血液样品制备装置的顶部，并置于离心机中，离心；(3)分离PBMC层：先用200μL Pipette Tip移液枪枪头移除上层血浆与血小板，再用新的Pipette Tip移液枪枪头取PBMC层置于1.5mL离心管中；(4)裂红：在含PBMC的离心管中加入1mL红细胞裂解液，摇晃后，冰上静置后离心，裂解PBMC中残留的红细胞；(5)清洗PBMC：离心后用移液枪小心移除上清液体，再加入1mL PBS缓冲液离心，最后移除上清；(6)收集PBMC：在清洗后的PBMC中加入PBS缓冲液，再离心，移除所有上清，收集沉淀，即得。...

【专利技术属性】
技术研发人员：应万涛，杨丽，王明超，翁爽，
申请(专利权)人：北京蛋白质组研究中心，
类型：发明
国别省市：