一种外泌体及外泌体RNA串联富集鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种外泌体及外泌体RNA串联富集鉴定方法。包括如下步骤：将TiO2微球与生物样本共同孵育以捕获生物样本中的外泌体，清洗去除非特异性吸附，得到表面附着有外泌体的TiO2微球；加入裂解/结合缓冲液，裂解外泌体使其释放内容物，继续孵育，使外泌体释放的RNA结合到TiO2上，清洗去除非特异性吸附，完成生物样本中exoRNA的富集，最后加入洗脱液将exoRNA洗脱下来，离心收集上清液即可。本发明专利技术操作简单，耗时短、成本低，相较于其他方法具有明显的优势。从外泌体富集，到exoRNA的释放，再到exoRNA的富集，整个过程仅需30min；同时裂解液中包含多种抑制RNase活性的成分，保证得到高质量exoRNA。质量exoRNA。质量exoRNA。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体及外泌体RNA串联富集鉴定方法


[0001]本专利技术涉及一种外泌体及外泌体RNA串联富集鉴定方法，涉及生物技术及分析化学领域。

技术介绍

[0002]核糖核酸(RNA)作为遗传信息的传递者，也是精准药物治疗中有吸引力的靶点。RNA包括编码蛋白的编码RNA(mRNA)和非编码RNA(ncRNA)；ncRNA虽然不编码蛋白质，但调控着生理和发育进程，同时在多种疾病的发生发展中扮演着关键调节因子；因此RNA也成为了潜在的疾病诊断标志物，为疑难杂症提供新的治疗方向。外泌体是由大多数真核细胞分泌的纳米级(30
‑
200nm)细胞外囊泡，包含可以在细胞之间传递和交联的蛋白质、RNA和DNA等生物分子；作为细胞间通信和信号转导的重要中介，在一系列生理和病理过程中发挥关键作用。研究发现，外泌体RNA(exoRNA)种类分布不同于体液，其中仅有少量甚至没有核糖体RNA，但包含大量的mRNA和ncRNA(miRNA、lncRNA等)。由于外泌体的囊泡结构可以保护RNA免受体液中的酶降解，因此，外泌体中各类RNA的含量相对于体液RNA更稳定，浓度更高，它们的病理生理作用正在各种疾病中被解码。有研究表明，exoRNA能够影响肿瘤的发生发展、转移、侵袭及肿瘤微环境，使得exoRNA成为极具应用前景的临床诊断分子标志物。获得质量好、完整性高的RNA是进行RNA下游相关分析和研究的前提。目前，RNA的提取方法主要包括乙醇沉淀法、基于苯酚、基于柱以及基于苯酚和柱组合的方法。这些方法存在提取时间长、步骤繁琐、成本高、有毒性等不足。发展快速、高效、经济绿色的RNA提取方法对于RNA的深度发掘具有重要生物学意义。同时已有研究表明现有的分离方法在exoRNA产量、纯度和大小模式分布方面存在广泛差异，还会影响小RNA的组成比、miRNA的含量和数量等。由于外泌体生物来源样品量少，外泌体含量少，相应exoRNA丰度低，因此exoRNA研究的关键在于外泌体的高效快速富集及RNA的特异性分离富集。基于此，亟需发展新的富集策略。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是利用TiO2‑
磷酸基团的特异性相互作用，提供一种外泌体及外泌体exoRNA串联富集鉴定的新策略。
[0004]本专利技术通过将TiO2微球与生物样本共同孵育以捕获其中的外泌体，加入裂解/结合缓冲液裂解外泌体使其释放内容物；释放的RNA进一步结合到TiO2上，完成体液外泌体及exoRNA的串联富集，最终通过测序技术对富集的RNA进行解析。本专利技术能够快速高效地从生物样本中共同提取外泌体及exoRNA。
[0005]本专利技术所提供的外泌体及外泌体exoRNA串联富集鉴定方法(流程图1所示)，包括如下步骤：
[0006]1)将TiO2微球与生物样本共同孵育以捕获生物样本中的外泌体，清洗去除非特异性吸附，得到表面附着有外泌体的TiO2微球；
[0007]2)加入裂解/结合缓冲液裂解外泌体使其释放内容物，继续孵育，使外泌体释放的
RNA结合到TiO2上，清洗去除非特异性吸附，完成生物样本中exoRNA的富集，最后加入洗脱液将RNA洗脱下来，离心收集上清液即可进行测序分析。
[0008]上述方法步骤1)中，所述生物样本可为血液、尿液、羊水等包含外泌体的样本，具体可为血清；
[0009]所述生物样本与TiO2微球共同孵育前，还需进行预处理。
[0010]所述生物样本为血清，所述预处理的操作为：取血清，分别在4℃条件下，经3000
×
g离心30分钟，12000
×
g离心30分钟后，收集上清，即为预处理后的血清样本。
[0011]所述TiO2微球的粒径可为25nm
‑
20μm，具体可为5μm、20μm、<100nm，更具体可为5μm。
[0012]所述生物样本为血清，TiO2微球与血清的配比可为：0.5mg：0.5mL；
[0013]所述孵育为4℃震荡孵育，孵育的时间可为5
‑
10min，具体可为5min；
[0014]所述清洗采用120～160mM NaCl/Tris
‑
HCl(pH＝7.4)缓冲液进行，所述清洗可进行多次，具体可为三次；
[0015]清洗用缓冲液与生物样本的配比可为：200μL：0.5mL
‑
1mL；
[0016]步骤2)的操作为：向所得表面附着有外泌体的TiO2微球中加入裂解/结合缓冲液，孵育10min，裂解外泌体使其释放RNA，并使释放的RNA与TiO2微球充分结合，加入1.5倍体积(相对于裂解/结合缓冲液的体积)的乙醇，混匀，进一步沉淀析出溶液中的RNA；低速离心弃去上清液；三轮清洗液洗涤沉淀，去除盐酸胍、异硫氰酸胍及蛋白质污染；低速离心弃上清后，将沉淀部分挥发残留乙醇；加入洗脱液和RNA酶抑制剂洗脱RNA，收集RNA溶液，将RNA洗脱液pH调节至中性，加DNaseⅠ处理去除DNA污染，实现血清外泌体及RNA的串联富集。
[0017]其中，所述裂解/结合缓冲液为：3M异硫氰酸胍/2M盐酸胍/0.1％β
‑
巯基乙醇/10％乙二醇(pH＝4.1)；每500μL
‑
1mL血清加入50μL的裂解/结合缓冲液；
[0018]所述清洗液分别为含60％、80％、90％乙醇的1M异硫氰酸胍溶液；每500μL
‑
1mL血清加入200μL的清洗液；
[0019]所述洗脱液为：20mM Tris
‑
EDTA(pH＝8.0)。
[0020]每500μL
‑
1mL血清加入20μL的洗脱液。
[0021]本专利技术首先提供了TiO2微球富集细胞RNA的方法，具体为常量细胞RNA的提取和微量细胞RNA的提取，证明TiO2提取复杂生物样本中RNA的可行性，包括如下步骤：
[0022]细胞培养至浓度约为80％，收集细胞后进行裂解，加入TiO2微球进行富集，孵育完成后，再加入乙醇混匀，细胞中的RNA结合到TiO2微球上，经清洗，离心收集沉淀，即可得到附着有RNA的TiO2微球，最后经洗脱缓冲液洗脱得到RNA溶液。
[0023]上述提取方法中，所述细胞为HeLa细胞，常量可为5～6
×
106个，具体可为5
×
106个；微量可为1～2
×
105个，具体可为1
×
105个；
[0024]上述提取方法中，裂解细胞的裂解/结合缓冲液为：3M异硫氰酸胍/2M盐酸胍/0.1％β
‑
巯基乙醇+10％乙二醇(pH＝4.1)，清洗所用清洗液分别为含60％、80％、90％乙醇的1M异硫氰酸胍溶液，所述洗脱缓冲液为：20mM Tris
‑
EDTA(pH＝8.0)；
[0025]上述提取方法中，裂解常量HeLa细胞时裂解/结合缓冲液用量可为400～50本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体及外泌体exoRNA串联富集鉴定方法，包括如下步骤：1)将TiO2微球与生物样本共同孵育以捕获生物样本中的外泌体，清洗去除非特异性吸附，得到表面附着有外泌体的TiO2微球；2)加入裂解/结合缓冲液裂解外泌体使其释放内容物，继续孵育，使外泌体释放的RNA结合到TiO2上，清洗去除非特异性吸附，完成生物样本中exoRNA的富集，最后加入洗脱液将exoRNA洗脱下来，离心收集上清液即可进行测序分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述生物样本为血液、尿液、羊水，具体可为血清；所述TiO2微球的粒径为25nm
‑
20μm；所述生物样本为血清，TiO2微球与血清的配比为：0.5mg：0.5mL。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述孵育为4℃震荡孵育，孵育的时间为5
‑
10min。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其特征在于：所述清洗采用120～160mM NaCl/Tris
‑
HCl缓冲液进行，所述清洗可进行多次，具体为三次；清洗用缓冲液与生物样本的配比为：200μL：0.5mL
‑
1mL。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其特征在于：步...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦伟捷，张宝英，
申请(专利权)人：北京蛋白质组研究中心，
类型：发明
国别省市：