肉毒毒素的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了肉毒毒素的功能表位FYQ*I，*可以是任意氨基酸，本发明专利技术还公开了与此功能表位特异性结合的抗肉毒毒素的单克隆抗体。本发明专利技术还公开了上述抗体在制备预防和/或治疗肉毒毒素中毒药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了肉毒毒素的功能表位FYQ*I，*可以是任意氨基酸，本专利技术还公开了与此功能表位特异性结合的抗肉毒毒素的单克隆抗体。本专利技术还公开了上述抗体在制备预防和/或治疗肉毒毒素中毒药物中的应用。【专利说明】肉毒毒素的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其应用
本专利技术属于生物
，具体的说，本专利技术公开了一种新的毒素功能表位、与这个表位特异性结合的单克隆抗体及其在制备预防和/或治疗毒素中毒药物中的用途。
技术介绍
肉毒梭菌(Clostridium botulium)是一种厌氧菌,是革兰氏阳性的孢子形成菌。肉毒毒素(botulium neurotoxin,简称BoNT)是由肉毒梭菌分泌的神经毒素,是目前自然界中人类已知生物和化学毒素中的毒性最强的毒素，肉毒毒素对人的半致死剂量LD50仅为0.lng-lng/kg，毒性比氰化物高一万倍。它作用于外周运动神经未稍，神经与肌肉的接合处，即突触处，抑制突触前膜释放神经递质乙酰胆碱，从而导致肌肉松驰性麻痹。食品污染、婴儿肠道感染和伤口感染是自然状态下引起人类肉毒中毒的主要因素。一个肉毒毒素分子就能阻断一个神经细胞的功能，抑制神经肌肉接合处乙酰胆碱的释放而产生毒性功能，严重中毒者由于其呼吸肌的深度麻痹导致呼吸衰竭而死亡。由于毒素具有超强的神经毒性、中毒死亡率高且易于生产的特点，肉毒毒素被FDA归为A级生物战剂，同时，也被列为六种最主要的战剂之一。因此，肉毒毒素无论是偶发的中毒事件，还是用其作为生物武器和生物恐怖性的战剂，其潜在的危害性难以估计。所以肉毒毒素的预防和治疗问题是国家和社会制定防御策略不得不考虑的问题，进行肉毒毒素的防治研究无论对国家的生物安全、公共卫生安全及人民生命健康安全都具有重要的现实意义。肉毒毒素有7种不同的血清型(BoNT/A-G)，其中A型、B型、E型和F型与人类肉毒中毒有关，各型肉毒毒素分子在结构和功能上有许多相似之处，均由轻链(L链，相对分子质量为50KD)和重链(H链，相对分子质量为100KD)组成，两者通过一个二硫键相连。重链的羧基端(He结构域)，为肉毒毒素的受体结合功能域，它负责与神经细胞特异地结合；而重链的氨基末端(H`n结构域)为一个跨膜转运功能结构域，具有帮助轻链进入细胞质的功能；轻链则具毒性的功能，它是一种Zn2+依赖性的肽链内切酶，可特异性地作用于SNARE蛋白复合体中的一种(VAMP/Synaptobrevin, Syntaxin, Snap-25,此三种蛋白是SNARE学说的关键蛋白，是神经突出小泡靶向和融合的载体(Rothman，1994)，同时也是BoNT内肽酶的作用底物)，影响突触小体的融合，从而抑制乙酰胆碱的释放，引起以驰缓性神经麻痹为主的一系列症状，结合功能域，转运功能域和催化酶切活性功能域呈线性排列，转运区域位于中间，而酶活性的催化区域和结合区域位于两侧(C M0NTECUCC0, SCHIAV0G.Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins.Quarterly Reviewsof Biophysics28，423-472 (1995))。肉毒梭菌最初产生的毒素是无活性的原毒素(单肽链)相对分子量为150KD，随后经肉毒梭菌自身的内源性蛋白水解酶消化分解为重链和轻链，从而产生活性，提高了肉毒毒素的毒力。肉毒毒素的毒理作用主要包括结合、转位、催化酶切这三个阶段。毒素通过He端受体结合域与神经细胞特异受体结合，在受体介导的内吞作用下内陷，诱导内体的酸性发生变化，引发毒素转运结构域的构象发生改变，同时囊泡腔在泡膜质子泵ATP酶作用下PH值降低，使疏水区域暴露，在膜上形成一个膜通道，LC通过该通道进入胞质，在神经细胞内，肉毒毒素分解相关的SNARES蛋白，阻断神经递质的释放从而导致一系列的中毒临床症状，其中作用机制的起始阶段，肉毒毒素与其神经细胞表面受体的特异结合是决定毒素分子毒性发生的关键步骤，是毒素进入细胞发挥毒性效应的前提。如果在起始阶段能阻断毒素与受体的相互作用，可以达到有效的毒素抑制作用(G SCHIAVO,BENFENATI FjPOULAINB，et al.Tetanus and botulinum—B neurotoxins block neurotransmitter release byproteolytic cleavage of synaptobrevin.Nature359,832-835(1992))0目前中毒后的治疗方面，唯一有效的治疗性药物是中和性抗体，治疗成人及婴儿肉毒毒素中毒，在中毒后24小时内可起到显著的保护作用。目前所使用的中和抗体为马源的血清抗毒素和BabyBIG，一种来源于健康的志愿者血液的IgG制品，用以治疗婴儿肉毒中毒，但这种药物供应有限。相对于人而言，马源的血清抗毒素具有强免疫原性，易引起一些副作用，近10 %的人使用后可能产生如荨麻疹，血清病等过敏性反应，而且存在着潜在病毒污染等问题，应用受到了极大的限制。因此研发新一代的防治药物，单克隆抗体和基因工程抗体是未来的必然趋势。近年来，国内外的研究热点集中在肉毒毒素中和抗体的研究方面，其中包括:鼠源单克隆抗体的制备和人源化研究，应用噬菌体展示技术进行毒素抗原的中和抗体表位定位研究，筛选及制备的抗肉毒毒素抗体，进行体内体外中和活性比较研究和中和活性的评价等，取得了很大的研究进展 。研究表明，BoNT/Hc片段包含保护性抗原基本决定簇(PPAPS)，作为免疫原能引发显著保护性免疫应答。最理想的重组疫苗是能引发显著保护性免疫应答的最小片段。Dertzbaugh等的研究将引发显著保护性免疫的片段进一步缩小至Β0ΝΤ/Α的Hl 150-1289的139个氨基酸范围，根据认为其他类型BoNT的He端也具有较强免疫保护作用。BoNT的重链与轻链相比，各型之间的同源性较低。重链中大约有110个氨基酸残基是较保守的(He以845个氨基酸残基计)保守程度最高的为Trp，B型肉毒毒素H链的13个Trp中有9个是保守的，虽然毒素重链同源性较低，但晶体结构学研究表明，A、B、E、F和TeNT之间的He可能具有相同的折叠方式，只是延伸的LOOP区域序列不同(B R SINGH.1ntimate detailsof the most poisonous poison.Nature structural biology7，617(2000))。但是，目前无论是肉毒毒素的单克隆抗体，还是基因工程中和性抗体的研发均处于实验室研究阶段，还没有一种中和性抗体上市销售。研制肉毒毒素中和性抗体进展缓慢，其中较大的困难是尽管获得了一些亲和力较高的中和抗体，但无论亲和力多高，单一抗体均不能很好地完全中和毒素，而联合使用两至三株抗体则可能大大提高中和活性(Nowakowski A, Wang C.Potent neutralization of botulinum neurotoxinby recombinant oligoclonal antibody.Proc Natl Acad Sci U S A.99(17):11346-11350(2000)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肉毒毒素BoNT/B?Hc功能表位FYQ*I，*可以是任意氨基酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭亚军，戴建新，陈长春，王华菁，张天成，夏天，张大鹏，钱卫珠，
申请(专利权)人：上海抗体药物国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：