一种在大肠杆菌中组成型、分泌型表达的载体制造技术

本发明专利技术涉及本发明专利技术涉及外源蛋白原核表达领域，具体是一种在大肠杆菌中组成型、分泌型表达的载体，其特征在于：由分泌型信号肽双链序列链接到组成型表达载体骨架构建而成，本发明专利技术的优点在于：外源基因在大肠杆菌表达时，可以在任意一种大肠杆菌中表达，不需要特殊的菌株；不需要进行诱导，可以自主表达；表达产物直接分泌到培养基中，以可溶形式存在，表达量高并且方便后续分离、纯化，并且某些在大肠杆菌体内表达对大肠杆菌有毒性的蛋白，也能够表达。

A vector expressing secreted expression in E. coli

The invention relates to the field of prokaryotic expression of exogenous protein, specifically a carrier of forming and secreting expression in the group of Escherichia coli, which is characterized by the construction of the secretory signal peptide double chain sequence linked to the framework of the constitutive expression vector. The advantage of the invention is that the foreign gene is expressed in Escherichia coli. It can be expressed in any Escherichia coli, without a special strain; it can be expressed independently without induction; the expression products are secreted directly into the medium and exist in a soluble form, high in expression and convenient for subsequent separation and purification, and some of them are toxic to Escherichia coli in the body of Enterobacter. The protein of sex can also be expressed.

【技术实现步骤摘要】
一种在大肠杆菌中组成型、分泌型表达的载体
本专利技术涉及外源蛋白原核表达领域，具体是一种在大肠杆菌中组成型、分泌型表达的载体。
技术介绍
将外源基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是现有的方法具有以下缺点：1、需要加诱导剂诱导，才能表达外源蛋白，并且每种外源蛋白的诱导条件不相同，所以要花费大量的时间、精力去摸索诱导外源蛋白表达的条件；2、大肠杆菌细胞内表达，蛋白表达量相对比较低、容易形成包涵体、某些对大肠杆菌有毒的蛋白不能表达；3、需要特定的大肠杆菌菌株才能表达外源蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在大肠杆菌中组成型、分泌型表达的载体，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为：一种在大肠杆菌中组成型、分泌型表达的载体，由分泌型信号肽双链序列链接到组成型表达载体骨架构建而成。所述的组成型表达载体的制作步骤为：1)用1xTE缓冲液将组成型启动子正片段溶解成100μM的组合型正片段溶液，将组成型启动子负片段溶解成100μM的组合型负片段溶液；2)各取1μl的组合型正片段溶液和组合型负片段溶液加到98μl的0.5xTE缓冲液，混合均匀成组合型正负片段混合液；3)将组合型正负片段混合液置于PCR仪，温度保持95℃，5min后取出放置于实验台，自然冷却至室温，正反向片段退火成双链，形成组成型启动子；4)将pET-22b载体经过BglII和XbaI双酶切，形成pET-22b载体骨架；5)将组成型启动子双链序列链接到pET-22b载体骨架，形成pET-22b组成型载体；6)将pET-22b组成型载体经过NdeI和NcoI双酶切，形成组成型表达载体。所述的分泌型信号肽的制作步骤为：1)用1xTE缓冲液将分泌型信号肽正片段溶解成100μM的分泌型正片段溶液，将分泌型信号肽负片段溶解成100μM的分泌型负片段溶液；2)各取1μl的分泌型正片段溶液和分泌型负片段溶液加到98μl的0.5xTE缓冲液，混合均匀成分泌型正负片段混合液；3)将分泌型正负片段混合液置于PCR仪，温度保持95℃，5min后取出放置于实验台，自然冷却至室温，正反向片段退火成双链，形成分泌型信号肽。作为优选，所述的组成型启动子正片段为CEPr-F：5’-GATCTAACATTGAGGCAACGACAAGGTCGATTCTGCTATCCTTGAGGAGGCTCCTCT-3’，所述的组成型启动子负片段为CEPr-R：5’-CTAGAGAGGAGCCTCCTCAAGGATAGCAGAATCGACCTTGTCGTTGCCTCAATGTTA-3’。作为优选，所述的分泌型信号肽正片段为OmpA-F：5’-TAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCGCTGC-3’，所述的分泌型信号肽负片段为OmpA-R：5’-CATGGCAGCGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGTGCCACTGCAATCGCGATAGCTGTCTTTTTCAT-3’。本专利技术的优点在于：外源基因在大肠杆菌表达时，可以在任意一种大肠杆菌中表达，不需要特殊的菌株；不需要进行诱导，可以自主表达；表达产物直接分泌到培养基中，以可溶形式存在，表达量高并且方便后续分离、纯化，并且某些在大肠杆菌体内表达对大肠杆菌有毒性的蛋白，也能够表达。附图说明图1是本专利技术实施例的WB检测图。具体实施方式下面用具体实施例说明本专利技术，并不是对本专利技术的限制。实施例1)用BglII和XbaI双酶切pET-22b载体，回收GFP编码基因；2)用NdeI和NcoI双酶切组成型分泌型表达载体，回收载体骨架；3)将GFP编码基因链接到组成型分泌型表达载体骨架，构建GFP组成型分泌型表达载体；4)将GFP组成型分泌型表达载体转化到大肠杆菌DH5α菌株中，随机挑取5个阳性克隆，在4mlLB液体培养基中37℃，200rpm培养约16小时，然后室温12，000rpm，离心5分钟，收集上清；取20ul上清进行WB检测，得WB检测图。据图1所示，GFP组成型分泌型表达载体的5个阳性克隆均在大肠杆菌DH5α菌株中，不经特殊的菌株，不进行诱导，做到自主表达。以上所述，仅为本专利技术较佳的具体实施方式，但本专利技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术揭露的技术范围内，根据本专利技术的技术方案及其专利技术构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在大肠杆菌中组成型、分泌型表达的载体，其特征在于：由分泌型信号肽双链序列链接到组成型表达载体骨架构建而成。

【技术特征摘要】
1.一种在大肠杆菌中组成型、分泌型表达的载体，其特征在于：由分泌型信号肽双链序列链接到组成型表达载体骨架构建而成。2.根据权利要求1所述的一种在大肠杆菌中组成型、分泌型表达的载体，其特征在于，所述的组成型表达载体的制作步骤为：1)用1xTE缓冲液将组成型启动子正片段溶解成100μM的组合型正片段溶液，将组成型启动子负片段溶解成100μM的组合型负片段溶液；2)各取1μl的组合型正片段溶液和组合型负片段溶液加到98μl的0.5xTE缓冲液，混合均匀成组合型正负片段混合液；3)将组合型正负片段混合液置于PCR仪，温度保持95℃，5min后取出放置于实验台，自然冷却至室温，正反向片段退火成双链，形成组成型启动子；4)将pET-22b载体经过BglII和XbaI双酶切，形成pET-22b载体骨架；5)将组成型启动子双链序列链接到pET-22b载体骨架，形成pET-22b组成型载体；6)将pET-22b组成型载体经过NdeI和NcoI双酶切，形成组成型表达载体。3.根据权利要求1所述的一种在大肠杆菌中组成型、分泌型表达的载体，其特征在于，所述的分泌型信号肽的制作步骤为：1)用1xTE缓冲液将分泌型信号肽正片段溶解成100μM的分泌型正片段溶液，将分泌型信号肽负片段溶解成100μM的分泌型负片段溶液；2)各取1μl...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈定武，
申请(专利权)人：广州嘉吉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44