检测甲型肝炎和戊型肝炎病毒的引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了重组酶聚合酶扩增检测甲型肝炎和戊型肝炎用引物探针组和试剂盒及检测方法，包括具有SEQ ID NO.1‑4所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.5‑6所示核苷酸序列的探针。本公开还提供了一种重组酶聚合酶扩增检测甲型肝炎和戊型肝炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本公开所述的引物探针组。通过上述技术方案本公开显著地提高了对甲型肝炎和戊型肝炎病毒检测的敏感性、特异性和简便性。

Primers, probes and kits for detection of hepatitis A and hepatitis E virus

The invention discloses a primer probe group and a kit and detection method for the detection of hepatitis A and hepatitis E by recombinant enzyme polymerase amplification, including a primer with a sequence of nucleotides shown in SEQ ID NO.1 4, and a probe containing the nucleotide sequence shown by the SEQ ID NO.5 SEQ. The present disclosure also provides a kit for the amplification of recombinant enzyme polymerase to detect hepatitis A and hepatitis E virus, and the kit includes the primer probe group described in the public. Through the above technical proposal, this disclosure significantly improves the sensitivity, specificity and simplicity of detection of hepatitis A and hepatitis E virus.

【技术实现步骤摘要】
检测甲型肝炎和戊型肝炎病毒的引物、探针及试剂盒
本公开涉及生物
，具体地，涉及一种检测甲型肝炎和戊型肝炎病毒用引物探针组及试剂盒和检测方法。
技术介绍
肝炎是在世界范围内广泛流行的严重危害人体健康甚至生命的严重疾病，目前主要分为甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎。根据传播途径可将其分为两大类，其中乙型、丙型、丁型、庚型肝炎的主要传播途径为血液传播、医源性传播、母婴传播、性传播，其中血液传播和性传播为最常见途径。而甲型和戊型肝炎的主要通过粪-口途径传播，多为大范围的急性传染病。甲肝、戊肝病毒在环境和食物中能长期存活，但却不能复制，在被污染的环境和食物中的病毒含量比较低(5-100感染颗粒)，传播无规律性。因此鉴定甲型、戊型肝炎暴发的病毒来源会有比较大的困难。即使人体摄入低剂量的病毒也可能导致人类疾病，严重危害人类健康。目前国内外均建立了采用PCR技术对甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒进行快速检测的方法。但是常规PCR检测需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，且耗时较长，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。核酸恒温扩增技术(LAMP)与传统PCR相比核酸恒温扩增技术不需要昂贵的PCR仪，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便、快速、灵敏等优点。但LAMP检测RNA样本需要设置单独的逆转录步骤，60-90min才可以完成反应，且对SNP识别度不够，引物结合区域单位点突变不能被LAMP识别。LAMP采用65℃恒温扩增，若待检测区域的GC含量过低、过高或者二级结构复杂，则扩增效果较差。且LAMP采用多组引物进行滚环复制，产物量巨大，极易污染实验环境，产生假阳性结果。随着全世界范围的人口数量增加及流动逐渐频繁，甲肝、戊肝在世界各国的短时间内的大流行、大爆发将更加频繁。因此，针对疫情的快速暴发、传播范围广的特点，建立灵敏度高、特异性强、检测时间短、检测成本低、操作简单方便、器材要求不高的甲型肝炎和戊型肝炎病毒检测技术，对病例的快速识别和疫情的传播控制具有非常重要意义。对公共卫生和食品安全方面防控具有重要的价值意义。
技术实现思路
本公开的目的是解决现有技术中不能对甲型肝炎和戊型肝炎进行快速、灵敏和特异的检测的缺陷，提供一种甲型肝炎和戊型肝炎病毒的检测引物探针和试剂盒，并建立一种基于重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技术的甲型肝炎和戊型肝炎病毒的快速、灵敏、特异，简便的检测方法。为了实现上述目的，本公开的第一个方面提供重组酶聚合酶扩增检测甲型肝炎和戊型肝炎病毒用引物探针组，其中，包括具有SEQIDNO.1-4所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.5-6所示核苷酸序列的探针；其中，SEQIDNO.5所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有FAM发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有VIC发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1。可选的，还包括具有SEQIDNO.7-8所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的探针；其中，SEQIDNO.9所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有CY5发光基团，第22位碱基后连接脱碱基位点，第25位碱基标记淬灭基团BHQ3，3’末端标记有磷酸盐基团。本公开的第二个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测甲型肝炎和戊型肝炎病毒的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总RNA；(2)以所述总RNA为模板，并使用本公开第一个方面所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；(3)收集FAM和VIC检测通道荧光信号，得到检测结果；a)若FAM荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有甲型肝炎病毒；b)若VIC荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有戊型肝炎病毒。可选的，每条引物的最终使用浓度各自为3.5-4.5μM，每条探针的最终使用浓度各自为0.8-1.2μM。可选的，重组酶聚合酶扩增反应的条件包括在25-43℃下恒温扩增5-20min。可选的，扩增反应体系中包括阳性内质控、逆转录酶、反应体系缓冲液、DNA重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、3’-5’核酸外切酶、dNTP和水中的至少一种。本公开的第三个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测甲型肝炎和戊型肝炎病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本公开第一个方面所述的引物探针组。本专利技术的有益效果在于：本公开建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测甲型肝炎和戊型肝炎双重检测方法，能够实现形态学、免疫学、LAMP以及单重实时荧光检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：(一)耗时短逆转录重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)不需将RNA转化为cDNA再进行扩增反应，只需要将RPA体系与逆转录酶混合，构建RT-RPA反应体系，就可直接以RNA为模板，实现逆转录与检测过程的一体化。整个反应20min即可完成，而RT-PCR、Real-timePCR、LAMP等技术仅逆转录过程就需要30min的时间，整个反应需要60-90min才可完成。(二)对仪器平台要求低RPA反应可在常温下进行，不需要配备专门的热循环扩增仪，更好的实现了甲型肝炎和戊型肝炎现场应急检测。(三)特异性好RPA可识别引物结合区的SNP，使得其对非检测目标有极强的辨识能力，而LAMP和普通Real-timePCR则无法识别SNP，这使得RPA检测的特异性明显优于LAMP和Real-timePCR。本专利技术所建立的检测方法特异性还体现在一整套引物探针的特异性。所有引物探针都经过Blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性实验验证能够很好的区分包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、庚型肝炎病毒等的核酸，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来。(四)最低检出限本专利技术所建立的检测方法的最低检出限可达到10拷贝/反应。(五)成本较低本专利技术所建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测甲型肝炎和戊型肝炎方法在操作性上降低了人力成本和时间成本。该方法无需复杂高端仪器，反应条件可仅为一步39度，无需复杂操作。(六)预防假阴性结果本专利技术反应体系中添加的IAC，可以有效的提示因为操作失误、反应抑制物等原因造成的假阴性检测结果。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开的一种实施方式提供了重组酶聚合酶扩增检测甲型肝炎和戊型肝炎病毒用引物探针组，其中，包括具有SEQIDNO.1-4所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.5-6所示核苷酸序列的探针；其中，SEQIDNO.5所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有FAM发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有VIC发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组酶聚合酶扩增检测甲型肝炎和戊型肝炎病毒用引物探针组，其特征在于，包括具有SEQ ID NO.1‑4所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.5‑6所示核苷酸序列的探针；其中，SEQ ID NO.5所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有FAM发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQ ID NO.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有VIC发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1。

【技术特征摘要】
1.重组酶聚合酶扩增检测甲型肝炎和戊型肝炎病毒用引物探针组，其特征在于，包括具有SEQIDNO.1-4所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.5-6所示核苷酸序列的探针；其中，SEQIDNO.5所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有FAM发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有VIC发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其中，还包括具有SEQIDNO.7-8所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的探针；其中，SEQIDNO.9所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有CY5发光基团，第22位碱基后连接脱碱基位点，第25位碱基标记淬灭基团BHQ3，3’末端标记有磷酸盐基团。3.一种重组酶聚合酶扩增检测甲型肝炎和戊型肝炎病毒的检测方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雷，林笑冬，张志强，
申请(专利权)人：北京卓诚惠生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11