HPV检测方法技术

本发明专利技术涉及使用PCR相关方法进行人乳头瘤病毒(HPV)基因型的检测，特别是生殖器人乳头瘤病毒基因型的检测。

HPV detection method

The invention relates to the detection of human papillomavirus (HPV) genotypes by using PCR related methods, especially the detection of genotypes of human papillomavirus.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】HPV检测方法本专利技术涉及人乳头瘤病毒(HPV)基因型的检测，特别是生殖器人乳头瘤病毒基因型的检测。人乳头瘤病毒及其意义据世界卫生组织(WHO)称，在女性中宫颈癌是癌症死亡的第二大常见原因。全世界99％以上的宫颈癌中都存在HPV感染。据估计，全世界每年有超过500,000名女性发展宫颈癌，超过273,000例是致命的。即使采用巴氏筛查方案，也有相当数量的女性每年死于宫颈癌。HPV感染是全球最常见的性传播疾病(STD)，高达60％的性活跃女性一生中会在生殖道内被HPV感染一次。不论HPV感染状况如何，不到1/10,000的女性会发展为浸润性宫颈癌。大部分HPV感染女性不发展细胞学异常或癌症的事实强调了在HPV感染女性中调节宫颈疾病至癌症的进展的因素的重要性。这些因素可能包括HPV基因型和分子变异、HPV病毒载量、HPV感染的持续存在、与其他STD媒介的共同感染、宿主的免疫状态及如吸烟等环境因素。乳头瘤病毒是感染哺乳动物上皮细胞的小DNA病毒，其引起上皮增生性病变，其可以是良性的，例如纤维化乳头瘤(疣)，或者可以是恶性的。所有乳头瘤病毒的相似之处在于，共享基因组大小、组织、开放阅读框和蛋白质功能。许多但不是全部的基因组区域在各种乳头瘤病毒中是保守的。由于乳头瘤病毒的生命周期和宿主细胞的分化状态之间的密切关联，乳头瘤病毒的生命周期的细节尚未完全阐明。已知乳头瘤病毒感染宿主上皮基底细胞，其中病毒基因组已经建立，并保持为与宿主细胞复制协同复制的低拷贝数附加体。当感染的细胞分化成角质形成细胞时，病毒DNA扩增，晚期基因被诱导，然后进行乳头瘤病毒的营养复制。乳头瘤病毒感染各种各样的动物，包括人类。人乳头瘤病毒(HPV)(包括乳头瘤病毒科，α-、β-、γ-、δ-、多发性乳头瘤病毒和未分类乳头瘤病毒属)是性传播疾病的常见原因。几种类型的HPV已经通过DNA序列数据被鉴定出来，迄今为止已有96种HPV基因型被完全测序。HPV的基因分型是基于L1、E6和E7基因的DNA序列。与先前建立的菌株相比，序列中10％差异足以定义新型病毒。人乳头瘤病毒组的异质性大概描述于deVilliers，1989，J.Virology63：4898-4903，将其通过引用并入本文。许多HPV类型的基因组已被测序和/或表征。根据可获得的分子、临床和流行病学数据，一部分HPV明确地是宫颈癌及其前体的病原体。在约90％的宫颈腺癌和鳞状细胞癌中检测到HPV。大部分HPV感染是自发清除的，但在来自宫颈肿瘤的转移中发现HPVDNA持续感染。然而，已知的高风险(或致癌性)HPV类型是宫颈癌的显著风险因素，并且其在其他癌症中的作用越来越被认可。几乎所有的宫颈癌(99％)都含有高风险型HPV的基因，最常见的类型是16、18、31和45。其他的高风险类型包括31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和73。HPV31、33、35、51和52有时被认为是“中等风险”，因为它们在轻度或重度发育不良病变中比在癌中更常见。在高风险菌株中，HPV16和18与宫颈癌密切相关。在超过50％的鳞状细胞癌中发现了HPV16DNA，而在超过50％的腺癌中发现了HPV18DNA。然而，绝大部分肛门与生殖器HPV具有致癌潜力。迄今为止，与HPV感染相关的临床疾病以及HPV检测和分型方法的潜在应用领域包括尖锐湿疣、硬化性苔藓、鳞状细胞增生、外阴上皮内瘤变、鳞状细胞癌、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌、子宫颈腺癌、肛门上皮内瘤变、阴茎上皮内瘤变、喉腺癌、复发性呼吸道乳头瘤病和疣状表皮发育不良。最近的证据表明，HPV也可能在男性前列腺癌的发展中发挥作用。在专利技术人GeorgePapanicolaou之后，使用称为巴氏涂片(Papsmear)的巴氏染色(PapanicolaouStain)测试宫颈癌前体病变(上皮内病变)或细胞学异常。该技术涉及在载玻片上涂抹子宫颈刮取物，并用细胞核染料苏木精将获自肛门-生殖道的细胞染色。然而，巴氏涂片缺乏可重复性，并不足以预测即将发生的HPV诱导的瘤形成。已经显示25％的晚期原位癌患者在诊断前几年可能呈现正常巴氏涂片，或者在宫颈癌病例复查时最后的阴性细胞学检查均为阳性。一个越来越普遍的问题是在阴性巴氏涂片的3年内发生浸润性癌症。当前可接受的假阴性率(即根据病理学家专家小组观察组织活检而不是涂片样品确实具有异常的女性，但在常规涂片筛查过程中未诊断出此)是大约5％～10％，但最近的研究表明，实际假阴性率可能要高得多。此外，约7％～8％的病例中，巴氏涂片显示意义不明的非典型鳞状细胞(ASCUS)。在另外20％～30％的病例中，由于炎性细胞的存在，巴氏涂片可能不足以用于解释。在宫颈的情况下，扁平疣(通过阴道镜检查可视化)是疑似癌前病变。已经很好地描述了扁平疣到原位癌和宫颈癌的组织病理学进程。上皮内病变是具有偶发性HPV感染的女性常见的早期事件，HPV-16或HPV-18感染与活检证实的CIN2-3级之间的间隔似乎相对较短。然而研究证明，高风险型HPV感染通常是短暂的。HPV感染的持续大大增加了进展为高级上皮内病变和浸润性疾病的风险。该疾病的进展是可变的，并且其与HPV的丢失或持续相关。大量异常病变自发消退，其他不能进展，而少数进展迅速。由于高风险基因型在宫颈癌中的优先作用，并且由于其他病理状态的不同结果性和特征性类型模式，所以HPV的鉴定和分型非常重要。另外不同类型的高风险HPV对受影响的个体构成不同的风险。例如，HPV16和HPV18在高级宫颈异常和癌症中比其他HPV类型更一致地被鉴定。HPV16也在鳞状癌病例中更普遍，HPV18在腺癌病例中更为普遍。HPV诊断自1980年以来，已经克隆了几种病毒基因组并在HPV诊断中用作类型特异性探针。滤膜杂交技术已经用于检测与用于常规细胞学的样品平行采集的宫颈刮取物中的HPVDNA。HPVDNA探针已经用于不同的基于杂交的测定，例如Southern和杂交Dot/Southern测定以检测来自临床的组织样品中的HPVDNA。另外，已经证明了纯化的活检DNA和保存组织试样中的原位杂交，即直接定位于与核酸探针互补的那些序列的完整细胞内。已经开发了多种方法来使用类型特异性反应检测人乳头瘤病毒类型，其一次检测一种HPV类型。已经使用聚合酶链式反应(PCR)来扩增和检测HPV16和HPV18DNA的存在，特别是在口腔和宫颈活检中检测HPV16。已经描述了通过PCR对1a、5、6a、8、11、16、18和33型中的HPV序列进行特异性扩增的引物混合物。美国专利号4,683,195和4,683,202公开了PCR和使用PCR以在样品中检测是否存在核酸序列。美国专利号5,447,839公开了用于HPV检测和分型的方法，将其通过引用并入本文。在该方法中，使用扩增致癌性和非致癌性HPV类型的共有引物通过PCR扩增样品中的HPVDNA序列。因此，通过扩增产物的形成来指示样品中HPV的存在。然后使用与DNA的扩增区域杂交的类型特异性DNA探针对HPV进行分型。在该专利中公开的类型特异性杂交探针能够鉴别和区分5种已知致癌类型的HPV，即HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18和HPV-33。已经设计了多种检测高风险型HPV本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测HPV存在的方法，其包括使用一种或多种扩增混合物扩增获自样品的核酸，其中所述扩增混合物选自：(a)扩增混合物1，其包含：5'‑TCATGCAGGAACATCCAGACT‑3'(SEQ.ID NO:1)5'‑CCAAACTTATTGGGGTCAGG‑3'(SEQ.ID NO:2)5'‑TTGCAGTTGGACATCCCTATTTTCC‑3'(SEQ.ID NO:3)(b)扩增混合物2，其包含：5'‑TCATGCTGGCAGCTCTAGATT‑3'(SEQ.ID NO:4)5'‑GGTCAGGTAACTGCACCCTAAA‑3'(SEQ.ID NO:5)5'‑AGGGTTCCTGCAGGTGGTGGC‑3'(SEQ.ID NO:6)(c)扩增混合物3，其包含：5'‑CACGCAGGCAGTGCTAGG‑3'(SEQ.ID NO:10)5'‑TCCAAATTTGTTTGGATCTGG‑3'(SEQ.ID NO:11)5'‑CAGTAGGCCATCCATATTATTCCATACC‑3'(SEQ.ID NO:12)(d)扩增混合物4，其包含：5'‑GCTGGTAGTTCCAGACTTCTTGC‑3'(SEQ.ID NO:13)5'‑CCAAATTTATTAGGATCTGGTAAACG‑3'(SEQ.ID NO:14)5'‑TGGTACCCAAAGTATCAGGCTTGCA‑3'(SEQ.ID NO:15)(e)扩增混合物5，其包含：5'‑TTATGCAGGCAGTTCTCGATT‑3'(SEQ.ID NO:16)5'‑GGGTCCGGCAATTTAATTCT‑3'(SEQ.ID NO:17)5'‑AGGACATCCCTATTTTTCTATTAAAAACACCAGT‑3'(SEQ.ID NO:18)(f)扩增混合物6，其包含：5'‑TATCATGCAGGCAGTTCACG‑3'(SEQ.ID NO:19)5'‑AAACTTATTAGGGTCGGGCAAC‑3'(SEQ.ID NO:20)5'‑GGACAATACCAAAACAAACATTCCCA‑3'(SEQ.ID NO:21)(g)扩增混合物7，其包含：5'‑TGCTGGCAGTTCCAGACTTT‑3'(SEQ.ID NO:22)5'‑AAACCAAATTTATTGGGATCAGG‑3'(SEQ.ID NO:23)5'‑TCCCAAGGTATCAGGCTTACAGTATAGGG‑3'(SEQ.ID NO:24)(h)扩增混合物8，其包含：5'‑ACGCAGGCAGTTCCAGACT‑3'(SEQ.ID NO:25)5'‑GGCCAAATTTATTGGGATCA‑3'(SEQ.ID NO:26)5'‑TGGTAGACAGGATGTTCCTAAGGTGTC‑3'(SEQ.ID NO:27)；或(i)扩增混合物9，其包含：5'‑TCATGCAGGCAGTTCTAGGC‑3'(SEQ.ID NO:31)5'‑GAAATCCAAACTTATTAGGATCTGGT‑3'(SEQ.ID NO:32)5'‑AGCAGTACCCAAGGTATCTGGTTTGCA‑3'(SEQ.ID NO:33)(j)扩增混合物10，其包含：5'‑ATGCTGGCAGCTCTAGATTATT‑3'(SEQ.ID NO:34)5'‑TTAGGATCGGGCAATGTCAC‑3'(SEQ.ID NO:35)5'‑TGAATGGTGGTCGCAAGCAGG‑3'(SEQ.ID NO:36)(k)扩增混合物11，其包含：5'‑GCAGGCAGTTCCCGATTATT‑3'(SEQ.ID NO:37)5'‑TCCAAATTTATTAGGATCGGGTAAA‑3'(SEQ.ID NO:38)5'‑CAG GCT GTT CCT AAG GTA TCC GCA‑3'(SEQ.ID NO:39)(l)扩增混合物12，其包含：5'‑TGCAGGCAGTTCCAGACTAA‑3'(SEQ.ID NO:40)5'‑GAGTCCAAACTTGTTAGGATCTGGT‑3'(SEQ.ID NO:41)5'‑CCTCAACGCGTGCTGCTATTCC‑3'(SEQ.ID NO:42)(m)扩增混合物13，其包含：5'‑TGCAGGTAGCTCTAGGTTGCT‑3'(SEQ.ID NO:43)5'‑TAGGATCAGGCAACCGTACC‑3'(SEQ.ID NO:44)CAAATCTGGTACCAAAACAAACATCCC‑3'(SEQ.ID NO:45)(n)扩增混合物14，其包含：TGCTGGTACATCTAGGTTATTAACTG‑3'(SEQ.ID NO:46)5'‑CAGGAACACTAAATTTATTAGGATCAGG‑3'...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.30 GB 1511470.51.一种检测HPV存在的方法，其包括使用一种或多种扩增混合物扩增获自样品的核酸，其中所述扩增混合物选自：(a)扩增混合物1，其包含：5'-TCATGCAGGAACATCCAGACT-3'(SEQ.IDNO:1)5'-CCAAACTTATTGGGGTCAGG-3'(SEQ.IDNO:2)5'-TTGCAGTTGGACATCCCTATTTTCC-3'(SEQ.IDNO:3)(b)扩增混合物2，其包含：5'-TCATGCTGGCAGCTCTAGATT-3'(SEQ.IDNO:4)5'-GGTCAGGTAACTGCACCCTAAA-3'(SEQ.IDNO:5)5'-AGGGTTCCTGCAGGTGGTGGC-3'(SEQ.IDNO:6)(c)扩增混合物3，其包含：5'-CACGCAGGCAGTGCTAGG-3'(SEQ.IDNO:10)5'-TCCAAATTTGTTTGGATCTGG-3'(SEQ.IDNO:11)5'-CAGTAGGCCATCCATATTATTCCATACC-3'(SEQ.IDNO:12)(d)扩增混合物4，其包含：5'-GCTGGTAGTTCCAGACTTCTTGC-3'(SEQ.IDNO:13)5'-CCAAATTTATTAGGATCTGGTAAACG-3'(SEQ.IDNO:14)5'-TGGTACCCAAAGTATCAGGCTTGCA-3'(SEQ.IDNO:15)(e)扩增混合物5，其包含：5'-TTATGCAGGCAGTTCTCGATT-3'(SEQ.IDNO:16)5'-GGGTCCGGCAATTTAATTCT-3'(SEQ.IDNO:17)5'-AGGACATCCCTATTTTTCTATTAAAAACACCAGT-3'(SEQ.IDNO:18)(f)扩增混合物6，其包含：5'-TATCATGCAGGCAGTTCACG-3'(SEQ.IDNO:19)5'-AAACTTATTAGGGTCGGGCAAC-3'(SEQ.IDNO:20)5'-GGACAATACCAAAACAAACATTCCCA-3'(SEQ.IDNO:21)(g)扩增混合物7，其包含：5'-TGCTGGCAGTTCCAGACTTT-3'(SEQ.IDNO:22)5'-AAACCAAATTTATTGGGATCAGG-3'(SEQ.IDNO:23)5'-TCCCAAGGTATCAGGCTTACAGTATAGGG-3'(SEQ.IDNO:24)(h)扩增混合物8，其包含：5'-ACGCAGGCAGTTCCAGACT-3'(SEQ.IDNO:25)5'-GGCCAAATTTATTGGGATCA-3'(SEQ.IDNO:26)5'-TGGTAGACAGGATGTTCCTAAGGTGTC-3'(SEQ.IDNO:27)；或(i)扩增混合物9，其包含：5'-TCATGCAGGCAGTTCTAGGC-3'(SEQ.IDNO:31)5'-GAAATCCAAACTTATTAGGATCTGGT-3'(SEQ.IDNO:32)5'-AGCAGTACCCAAGGTATCTGGTTTGCA-3'(SEQ.IDNO:33)(j)扩增混合物10，其包含：5'-ATGCTGGCAGCTCTAGATTATT-3'(SEQ.IDNO:34)5'-TTAGGATCGGGCAATGTCAC-3'(SEQ.IDNO:35)5'-TGAATGGTGGTCGCAAGCAGG-3'(SEQ.IDNO:36)(k)扩增混合物11，其包含：5'-GCAGGCAGTTCCCGATTATT-3'(SEQ.IDNO:37)5'-TCCAAATTTATTAGGATCGGGTAAA-3'(SEQ.IDNO:38)5'-CAGGCTGTTCCTAAGGTATCCGCA-3'(SEQ.IDNO:39)(l)扩增混合物12，其包含：5'-TGCAGGCAGTTCCAGACTAA-3'(SEQ.IDNO:40)5'-GAGTCCAAACTTGTTAGGATCTGGT-3'(SEQ.IDNO:41)5'-CCTCAACGCGTGCTGCTATTCC-3'(SEQ.IDNO:42)(m)扩增混合物13，其包含：5'-TGCAGGTAGCTCTAGGTTGCT-3'(SEQ.IDNO:43)5'-TAGGATCAGGCAACCGTACC-3'(SEQ.IDNO:44)CAAATCTGGTACCAAAACAAACATCCC-3'(SEQ.IDNO:45)(n)扩增混合物14，其包含：TGCTGGTACATCTAGGTTATTAACTG-3'(SEQ.IDNO:46)5'-CAGGAACACTAAATTTATTAGGATCAGG-3'(SEQ.IDNO:47)5'-CTATGTCTGGGGGCCGCAAG.-3'(SEQ.IDNO:48)；其中，SEQIDNO:3、6、12、15、18、21、24、27、33、36、39、42、45和48标记有猝灭剂和染料，一个在5'末端，一个在3'末端。2.一种检测HPV存在的方法，其包括使用一种或多种扩增混合物扩增获自样品的核酸，其中，所述扩增混合物选自：(a)扩增混合物15，其包含：5'-TCATGCAGGAACATCCAGACT-3'(SEQ.IDNO:1)5'-CCAAACTTATTGGGGTCAGG-3'(SEQ.IDNO:2)5'-TTGCAGTTGGACATCCCTATTTTCC-3'(SEQ.IDNO:3)5'-TCATGCTGGCAGCTCTAGATT-3'(SEQ.IDNO:4)5'-GGTCAGGTAACTGCACCCTAAA-3'(SEQ.IDNO:5)5'-AGGGTTCCTGCAGGTGGTGGC-3'(SEQ.IDNO:6)(b)扩增混合物16，其包含：5'-CACGCAGGCAGTGCTAGG-3'(SEQ.IDNO:10)5'-TCCAAATTTGTTTGGATCTGG-3'(SEQ.IDNO:11)5'-CAGTAGGCCATCCATATTATTCCATACC-3'(SEQ.IDNO:12)5'-GCTGGTAGTTCCAGACTTCTTGC-3'(SEQ.IDNO:13)5'-CCAAATTTATTAGGATCTGGTAAACG-3'(SEQ.IDNO:14)5'-TGGTACCCAAAGTATCAGGCTTGCA-3'(SEQ.IDNO:15)5'-TTATGCAGGCAGTTCTCGATT-3'(SEQ.IDNO:16)5'-GGGTCCGGCAATTTAATTCT-3'(SEQ.IDNO:17)5'-AGGACATCCCTATTTTTCTATTAAAAACACCAGT-3'(SEQ.IDNO:18)5'-TATCATGCAGGCAGTTCACG-3'(SEQ.IDNO:19)5'-AAACTTATTAGGGTCGGGCAAC-3'(SEQ.IDNO:20)5'-GGACAATACCAAAACAAACATTCCCA-3'(SEQ.IDNO:21)5'-TGCTGGCAGTTCCAGACTTT-3'(SEQ.IDNO:22)5'-AAACCAAATTTATTGGGATCAGG-3'(SEQ.IDNO:23)5'-TCCCAAGGTATCAGGCTTACAGTATAGGG-3'(SEQ.IDNO:24)5'-ACGCAGGCAGTTCCAGACT-3'(SEQ.IDNO:25)5'-GGCCAAATTTATTGGGATCA-3'(SEQ.IDNO:26)5'-TGGTAGACAGGATGTTCCTAAGGTGTC-3'(SEQ.IDNO:27)；或(c)扩增混合物17，其包含：5'-TCATGCAGGCAGTTCTAGGC-3'(SEQ.IDNO:31)5'-GAAATCCAAACTTATTAGGATCTGGT-3'(SEQ.IDNO:32)5'-AGCAGTACCCAAGGTATCTGGTTTGCA-3'(SEQ.IDNO:33)5'-ATGCTGGCAGCTCTAGATTATT-3'(SEQ.IDNO:34)5'-TTAGGATCGGGCAATGTCAC-3'(SEQ.IDNO:35)5'-TGAATGGTGGTCGCAAGCAGG-3'(SEQ.IDNO:36)5'-GCAGGCAGTTCCCGATTATT-3'(SEQ.IDNO:37)5'-TCCAAATTTATTAGGATCGGGTAAA-3'(SEQ.IDNO:38)5'-CAGGCTGTTCCTAAGGTATCCGCA-3'(SEQ.IDNO:39)5'-TGCAGGCAGTTCCAGACTAA-3'(SEQ.IDNO:40)5'-GAGTCCAAACTTGTTAGGATCTGGT-3'(SEQ.IDNO:41)5'-CCTCAACGCGTGCTGCTATTCC-3'(SEQ.IDNO:42)5'-TGCAGGTAGCTCTAGGTTGCT-3'(SEQ.IDNO:43)5'-TAGGATCAGGCAACCGTACC-3'(SEQ.IDNO:44)CAAATCTGGTACCAAAACAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·塔卡斯，
申请(专利权)人：塞尔考有限公司，
类型：发明
国别省市：匈牙利,HU