本发明专利技术公开了一种用于丙肝病毒分型和耐药位点检测的探针和方法。本发明专利技术的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑17所示。本发明专利技术提供的探针能够用于丙肝病毒分型和耐药位点检测，并且可用于多种(总数量>46种)HCV病毒亚型的分型以及耐药位点检测，可有效地筛选合适的药物，避免使用已免疫的药物，做到个性化治疗。
A probe and method for hepatitis C virus typing and drug resistance detection
The invention discloses a probe and a method for hepatitis C virus typing and drug resistance detection. The nucleotide sequence of the probe of the invention is shown as SEQ ID NO:1 17. The probe provided by the present invention can be used for hepatitis C virus typing and detection of resistance loci, and can be used in the typing of a variety of (total number > 46) HCV subtypes and detection of resistance loci, which can effectively screen the appropriate drugs, avoid the use of the immunized drugs and achieve a sexual treatment.
【技术实现步骤摘要】
一种用于丙肝病毒分型和耐药位点检测的探针和方法
本专利技术涉及丙肝病毒检测
，尤其涉及一种用于丙肝病毒分型和耐药位点检测的探针和方法。
技术介绍
丙肝病毒(HCV)是单股正链的RNA病毒，基因组全长约为9.6kb。HCV基因组由两端两个非编码区(UTR)和中间的一个开放阅读框(ORF)组成。ORF区又依次分为C区、E1区、E2区、NS1区、NS2区、NS区、NS4A区、NS4B区、NS5A区和NS5B区。由于HCV复制时所依赖的多聚酶缺乏校对功能，加上其本身为适应环境和逃避宿主的免疫监视作用而易发生突变，因此在长期的演化过程中逐渐形成了众多突变株，即基因型。HCV基因型基分为6种基因型(1-6)，各基因型由分为a/b/c等各种亚型，目前已超过80种亚型。不同基因型HCV引起的丙型肝炎病症、病情程度判断以及抗病毒药物治疗的使用等有明显差别。目前认为HCV1B型与重型肝炎和病情进行性发展有关，占总数的80％。在肝硬化失代偿期、原发性肝癌和肝移植术后复发的患者中也以1b型多见。Amoroso等(1998)发现92％的1b型急性感染HCV患者会发展为慢性丙型肝炎，而其他基因型转化概率则为35％-50％。姜树朋等(2015年)研究发现不同基因型HCV感染与血液中HCV的病毒浓度相关，基因1型患者HCV浓度高于非1型患者；不同基因型HCV病患者需要使用不同抗病药物，如Ⅲ型HCV感染者对IFN-α2b的完全应答率显著高于Ⅱ型HCV感染者(P<0.005)，而Ⅲ型HCV感染者对IFN-α2b的无应答率显著低于Ⅱ型HCV感染者(P<0.005)。Telaprevir与聚乙二醇干扰素(PEG－IFN)/ribavirin联合用药仅限于感染HCV基因1型的患者；2014年4月，欧洲肝病学会(EASL)在线发表了最新的《丙型肝炎治疗指南》，对各种基因型HCV给出相应的治疗方案，并指出启动治疗前，应评估HCV基因型和基因1亚型(1a/1b)，以确定治疗方案的选择。HCV病毒复制时的高自然错配率及RNA聚合酶保真性低的特点产生的位点突变，在使用药物一段时间后，形成病毒耐药性，引起病毒量反弹，限制了DAA临床应用。HIV研究协会论坛(ForumforCollaborativeHIVResearch)在2012年报告了临床相关的HCV突变位点以及耐药性分析。而在2015年6月份该机构和药品评价与研究中心(CenterforDrugEvaluationandResearch)等发布了一份更加详细和更多的HCVDAA药物治疗相关耐药位点报告，该报告罗列出了各基因型HCVNS3、NS5A、NS5B区域相关的突变位点，使用各种DAA药物后产生的位点突变与野生型复制子倍数分析(fold-change)，以及各种DAA药物对应的耐药位点、HCV基因型以及耐药性分析(fold-resistance)等。HCV基因分型方法主要包括分子学方法(包括测序法、特异性引物PCR法、特异性探针杂交(LIPA)、基因芯片法、限制性片段长度多态性分析(RFLP)法等)、血清学方法(包括重组免疫印迹试验(RIBA)和酶免疫试验(EIA))。其中测序法通过PCR扩增有代表性的基因片段如5’NTR区、C区、NS5B区、再进行核苷酸序列测定，为HCV基因分型的“金标准”。这些方法能有效区分主要的基因型，但只有核苷酸的直接测序在区分亚型中是有效的。现有HCV基因分型技术主要针对基因组中特定某个基因区域进行检测分析，部分方法存在不稳定、准确性较低，且只能分型至基因型，而亚型分型能力则非常有限。现有分型方法也基本上无法进行耐药位点检测。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于丙肝病毒分型和耐药位点检测的探针和方法，可用于多种HCV病毒亚型的分型以及耐药位点检测，可有效地筛选合适的药物，避免使用已免疫的药物，做到个性化治疗。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种用于丙肝病毒分型和耐药位点检测的探针，该探针的核苷酸序列如SEQIDNO：1-17所示。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种用于丙肝病毒分型和耐药位点检测的试剂盒，该试剂盒包括探针，上述探针的核苷酸序列如SEQIDNO：1-17所示。进一步地，上述试剂盒还包括：用于提取丙肝病毒RNA的试剂成分。进一步地，上述试剂盒还包括：用于反转录丙肝病毒RNA的试剂成分。进一步地，上述试剂盒还包括：用于对丙肝病毒RNA反转录后得到的cDNA进行文库构建的成分。进一步地，上述对cDNA进行文库构建的成分包括：用于末端修复的成分，用于3’末端加A碱基的成分，用于接头连接的成分，用于PCR扩增的成分。进一步地，上述试剂盒还包括：用于文库捕获的成分。根据本专利技术的第三方面，本专利技术提供一种用于丙肝病毒分型和耐药位点检测的基因芯片，该基因芯片包括固体载体和探针，上述探针的核苷酸序列如SEQIDNO：1-17所示。根据本专利技术的第四方面，本专利技术提供一种用于丙肝病毒分型的方法，该方法包括如下步骤：核酸的提取与处理：对全血或分离后的血浆样本，采用RNA病毒提取试剂进行病毒RNA的提取；然后进行反转录将RNA合成为双链cDNA；文库的构建：对上述获得的双链cDNA进行文库的构建；文库捕获：使用核苷酸序列如SEQIDNO：1-17所示的捕获探针对构建好的文库进行杂交捕获；测序：对捕获后的文库，进行高通量测序；信息分析：对获得的原始下机数据进行人源序列的去除，然后与现有的HCV参考序列进行比对，得到最终的样品HCV的全基因序列，以及丙肝病毒的分型。根据本专利技术的第五方面，本专利技术提供一种用于丙肝病毒耐药位点检测的方法，该方法包括如下步骤：核酸的提取与处理：对全血或分离后的血浆样本，采用RNA病毒提取试剂进行病毒RNA的提取；然后进行反转录将RNA合成为双链cDNA；文库的构建：对上述获得的双链cDNA进行文库的构建；文库捕获：使用核苷酸序列如SEQIDNO：1-17所示的捕获探针对构建好的文库进行杂交捕获；测序：对捕获后的文库，进行高通量测序；信息分析：对获得的原始下机数据进行人源序列的去除，然后与现有的HCV参考序列进行比对，得到最终的样品HCV的全基因序列，以及相应的突变信息和耐药位点。本专利技术提供的探针能够用于丙肝病毒分型和耐药位点检测，并且可用于多种(总数量>46种)HCV病毒亚型的分型以及耐药位点检测，可有效地筛选合适的药物，避免使用已免疫的药物，做到个性化治疗。具体实施方式下面通过具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。本专利技术基于46种HCV基因亚型的基因组区域进行探针设计，通过捕获、二代测序技术可提供更加准确、稳定的检测结果，可准确分型出大部分的HCV亚型；同时本专利技术可做耐药位点检测，为用药提供更加准确的指导。一、探针设计与合成：从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载46种HCV基因亚型作为探针设计的参考序列；去除各基因组之间重复序列，只保留一个拷贝；综合考虑探针长度、Tm值、重复序列比率、GC含量、特异性、目标区域覆盖深度等信息，设计出每条探针长度为90bp，允许的最大GC含量为60％。探针设计后使用寡核苷酸(oligo)合成仪进行合成，并配置配套的使用试剂。基于中国常见的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于丙肝病毒分型和耐药位点检测的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑17所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于丙肝病毒分型和耐药位点检测的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO：1-17所示。2.一种用于丙肝病毒分型和耐药位点检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括探针，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO：1-17所示。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于提取丙肝病毒RNA的试剂成分。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于反转录丙肝病毒RNA的试剂成分。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于对丙肝病毒RNA反转录后得到的cDNA进行文库构建的成分。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述对cDNA进行文库构建的成分包括：用于末端修复的成分，用于3’末端加A碱基的成分，用于接头连接的成分，用于PCR扩增的成分。7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于文库捕获的成分。8.一种用于丙肝病毒分型和耐药位点检测的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括固体载体和探针，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO：1-17所示。9.一种用于丙肝病毒分型的方法，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟宏彬，朱小龙，姚秋林，汪智蛟，陈俊清，刘娜，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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