一种用于检测肠腺病毒的引物、探针和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测肠腺病毒的引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。所述引物和探针包括：用于检测肠腺病毒的正向引物、用于检测肠腺病毒的反向引物和用于检测肠腺病毒的探针。所述试剂盒包括上述的引物和探针。所述引物、探针和试剂盒，具有灵敏度高的特性，能够准确检测样品是否感染肠腺病毒。

Primer, probe and kit for detecting intestinal adenovirus

The invention discloses a primer, probe and reagent kit for detecting enteroadenovirus, belonging to the field of biotechnology. The primers and probes include a forward primer for detecting intestinal adenovirus, a reverse primer for detecting intestinal adenovirus and a probe for detecting enteroadenovirus. The kit includes the primers and probes mentioned above. The primers, probes and kits have the characteristics of high sensitivity and can accurately detect whether the samples are infected with enteroviruses.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测肠腺病毒的引物、探针和试剂盒
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种用于检测肠腺病毒的引物、探针和试剂盒。
技术介绍
腺病毒是一种常见的病毒感染，有许多不同的临床表现，有时临床症状很独特，可以作明确的诊断，然而大多数的病例，腺病毒引起的症状很难跟其它病原引起的作区分。腺病毒最常造成呼吸道及肠胃道的感染。1981年以来，国外Kidd、Takiff等最早从腹泻病人粪便中分离出肠道型腺病毒(EAD)，以后DeTong用限制性内切酶分析EAD，发现其有两种不同电泳图谱，名为Ad-40及Ad-41。腺病毒胃肠炎广泛分布于全世界，检出率为5％～14％，其中Ad-40和Ad-41占70％左右。腺病毒胃肠炎的最小发病年龄为1个月，绝大多数发生于3岁以下的婴幼儿。Ad-40主要感染1岁左右婴儿，Ad-41则感染稍大的幼儿，全年均可发病，但腺病毒性胃肠炎一般呈散发性。腺病毒胃肠炎的潜伏期约10天，主要表现为腹泻，量少或多，呈水样便或稀便，少数患者可排出粘液，病程4～8天，常伴呕吐。部分患者有呼吸道症状，少数患者发热，病程多自限，排毒时间约1周。某些患者失水较严重，个别重度失水者可死亡。由于对这一病毒的致病作用不够重视，尚无常规细胞培养。诊断本病虽可采用DNA限制性内切酶检测法，但此法有一定局限性，不易推广。有人认为采用聚丙烯胺凝胶电泳法既能检测Ad，又可检测粪便中轮状病毒，敏感度高于电镜。对腺病毒性胃肠炎的治疗主要是对症治疗，可口服世界卫生组织推荐的口服补液盐，必要时给予静脉补液。
技术实现思路
为了解决现有技术中抗体检测不准确的问题，本专利技术实施例提供了一种用于检测肠腺病毒的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如下：一方面，本专利技术实施例提供了一种用于检测肠腺病毒的引物和探针，所述引物和探针包括：用于检测肠腺病毒的正向引物、用于检测肠腺病毒的反向引物和用于检测肠腺病毒的探针，其中，所述用于检测肠腺病毒的正向引物如序列表中SEQIDNO.1所示；所述用于检测肠腺病毒的反向引物如序列表中SEQIDNO.2所示；所述用于检测肠腺病毒的探针如序列表中SEQIDNO.3所示；所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。另一方面，本专利技术实施例提供了一种用于检测肠腺病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针。具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，所述工作标准品1为1×107拷贝/mL的所述肠腺病毒的基因片段；所述工作标准品2为1×106拷贝/mL的所述肠腺病毒的基因片段；所述工作标准品3为1×105拷贝/mL的所述肠腺病毒的基因片段；所述工作标准品4为1×104拷贝/mL的所述肠腺病毒的基因片段。具体地，所述阳性质控品为1.0×106拷贝/mL的所述肠腺病毒的T抗原基因片段。具体地，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0.05-0.9μM，所述探针的终浓度为0.05-0.9μM。具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。具体地，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0.03-0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0.4％的壬基酚聚氧乙烯(40)醚和pH值为8.3的终浓度为0.01-0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷。具体地，所述临界阳性质控品为1.0×104拷贝/mL的所述肠腺病毒的基因片段。具体地，所述阴性质控品为浓度0.8％的生理盐水。本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术实施例提供的用于检测肠腺病毒的引物和探针，具有灵敏度高的特性，能够准确检测样品是否感染肠腺病毒，本专利技术实施例提供的用于检测肠腺病毒的试剂盒，具有灵敏度高的特性，能够准确检测样品是否感染肠腺病毒，采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测结果可靠，提高了检测的灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段该试剂盒也可以进行有效的检测；检测速度快，整个检测过程共仅需2～3小时。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例2提供的荧光扩增曲线图；图2是本专利技术实施例3提供的荧光扩增曲线图；图3是本专利技术实施例4提供的荧光扩增曲线图；图4是本专利技术实施例5提供的标准曲线的荧光扩增曲线图；图5是本专利技术实施例5提供的荧光扩增曲线图；图6是本专利技术实施例5提供的由图4得到的标准曲线图，图6横坐标为LogStartingQuantitycopynumber，纵坐标为ThresholdCycle。图中：Cycles为循环数，RFU为荧光值，LogStartingQuantitycopynumber为水痘带状疱疹病毒起始浓度的对数值，Ct(ThresholdCycle)值为循环数；1a-实施例2中样品1，4a-实施例2中样品4，5a-实施例2中样品5，6a-实施例2中样品6，7a-实施例2中样品7。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂和探针主要购自宝生物工程(大连)有限公司。实施例1.一种用于肠腺病毒核酸定量检测的引物和荧光探针本专利技术实施例提供了一种用于检测肠腺病毒的引物和探针，引物和探针包括：用于检测肠腺病毒的正向引物、用于检测肠腺病毒的反向引物和用于检测肠腺病毒的探针，其中，用于检测肠腺病毒的正向引物如序列表中SEQIDNO.1所示；用于检测肠腺病毒的反向引物如序列表中SEQIDNO.2所示；用于检测肠腺病毒的探针如序列表中SEQIDNO.3所示；探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本专利技术实施例中，探针的荧光报告基团为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm；淬灭基团为Eclipse。纯化方式可选自：HAP、PAGE和HPLC纯化方式，具体地引物和探针如下表：表1.肠腺病毒引物和探针表1中：F：forward，正向；肠腺病毒-F表示肠腺病毒的正向引物。R：reverse，反向；肠腺病毒-R表示肠腺病毒的反向引物。P：probe，荧光探针(探针)；肠腺病毒-P表示肠腺病毒荧光探针，荧光探针可以为TaqMan-MGB荧光探针、LNA荧光探针或MGB荧光探针。表1的设计的引物和探针均委托宝生物工程(大连)有限公司合成。本专利技术实施例提供的引物和探针具有灵敏度高的特性，且能够准确检测出待测样品中的肠腺病毒的含量。实施例2.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测肠腺病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：用于检测肠腺病毒的正向引物、用于检测肠腺病毒的反向引物和用于检测肠腺病毒的探针，其中，所述用于检测肠腺病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述用于检测肠腺病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述用于检测肠腺病毒的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

【技术特征摘要】
2017.09.27 CN 20171088587241.一种用于检测肠腺病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：用于检测肠腺病毒的正向引物、用于检测肠腺病毒的反向引物和用于检测肠腺病毒的探针，其中，所述用于检测肠腺病毒的正向引物如序列表中SEQIDNO.1所示；所述用于检测肠腺病毒的反向引物如序列表中SEQIDNO.2所示；所述用于检测肠腺病毒的探针如序列表中SEQIDNO.3所示；所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。2.一种用于检测肠腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物和探针。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，所述工作标准品1为1×107拷贝/mL的所述肠腺病毒的基因片段；所述工作标准品2为1×106拷贝/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：石康，朱玉华，刘映乐，朱世新，
申请(专利权)人：湖北朗德医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42