一种检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法，包括如下步骤：提取病毒DNA和RNA，并将RNA进行反转录，同时进行CSFV、PPV、PRRSV、JEV特异性引物设计。然后，对设计的引物进行PCR反应条件的优化，从而确定最佳多重PCR模式。按照最佳多重PCR反应条件进行试验，验证多重PCR的特异性、敏感性以及稳定性，同时进行临床样品检测以验证此方法操作的可行性。此外，本发明专利技术还公布了用于同时检测CSFV、PPV、PRRSV、JEV的引物序列。本发明专利技术的四种猪病毒性繁殖障碍性疾病的多重PCR体系及检测方法，不仅保留了常规PCR的高特异性、敏感性，又减少了操作步骤，实现了一次扩增可同时检测多种微生物的目的，大大节省了时间，节约了经费开支。

A PCR system for detection of porcine viral reproductive disorders and its detection method

The present invention discloses a PCR system and detection method for detecting swine viral reproductive disorders, including the following steps: extraction of virus DNA and RNA, reverse transcription of RNA, and design of CSFV, PPV, PRRSV, JEV specific primers. Then, the PCR reaction conditions of the primers were optimized to determine the optimal multiplex PCR mode. According to the optimal multiple PCR reaction conditions, the specificity, sensitivity and stability of multiple PCR were verified, and the clinical samples were tested to verify the feasibility of the operation. In addition, the invention also discloses a primer sequence for simultaneous detection of CSFV, PPV, PRRSV and JEV. The multiple PCR system and detection method of the four kinds of swine viral reproductive disorders of the present invention not only retain the high specificity and sensitivity of the conventional PCR, but also reduce the operation steps, and realize the purpose of detecting a variety of microorganisms at the same time, greatly saving the time and saving the expenditure.

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法
本专利技术涉及农业和动物检疫领域，具体是一种检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法。
技术介绍
随着我国规模化养殖场的不断扩大，密集型的饲养方式大大增加了猪群之间的接触几率，接触几率的增加加快了疾病传播的同时，也使得患病猪常呈现混合感染现象，其中猪繁殖障碍性疾病已成为大中型猪场最重要的疫病之一，且呈全球性分布，我国当前仍以猪瘟(CSF)、猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)、猪圆环病毒病(PCVDA)、猪细小病毒病(PPI)、猪日本乙型脑炎(JE)造成的繁殖障碍最为普遍和严重，给养猪业造成了巨大的经济损失。现有的猪繁殖障碍性疾病的检测方法有血清学方法以及分子生物学方法等。血清学方法包括中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳胶凝集试验、血凝试验与血凝抑制试验，胶体金免疫层析，其中中和试验应用较为广泛。分子生物学方法灵敏度高、特异性好，该方法主要包括核酸探针、基因芯片、PCR检测等。而对于基因芯片来说，传统的芯片平台因依赖于荧光标记技术，需要昂贵的扫描设备进行扫描以及操作过程复杂，对技术要求较高，难以做到基层推广。多重P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)PPV病毒DNA的提取；(2)CSFV、PRRSV、JEV病毒RNA的提取以及反转录；(3)特异性引物设计与筛选；(4)对步骤(3)所设计的特异性引物进行PCR反应条件优化；(5)按照步骤(4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR扩增特异性验证；(6)按照步骤(4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR敏感性验证；(7)按照步骤(4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR稳定性验证；(8)按照建立的多重PCR方法对临床样品的检测。

【技术特征摘要】
1.一种检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)PPV病毒DNA的提取；(2)CSFV、PRRSV、JEV病毒RNA的提取以及反转录；(3)特异性引物设计与筛选；(4)对步骤(3)所设计的特异性引物进行PCR反应条件优化；(5)按照步骤(4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR扩增特异性验证；(6)按照步骤(4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR敏感性验证；(7)按照步骤(4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR稳定性验证；(8)按照建立的多重PCR方法对临床样品的检测。2.根据权利要求1所述的检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的PPV病毒DNA的提取方法为：取适量PPV病毒液，置于1.5mLEppendorf管中，参照OMEGA公司的E.Z.N.ATMTissueDNAKit提取试剂盒说明书进行，将提取的基因组DNA置于-20℃保存备用。3.根据权利要求1所述的检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法，其特征在于，步骤(2)中，CSFV、PRRSV、JEV病毒RNA的提取及反转录方法为：取CSFV、PRRSV和JEV病毒液，参照TaKaRa公司MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit说明书提取病毒RNA，将提取的病毒RNA反转录成cDNA；按照Magen公司M-MLVH-First-StandSynthesisKit反转录试剂盒说明书进行，将反转录的cDNA置于-20℃保存备用。4.根据权利要求1所述的检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的PCR体系及检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述特异性引物的设计与筛选具体为：应用生物学软件对CSFV基因、PPV基因、PRRSV基因和JEV基因进行同源性分析，筛选确定引物，确保所设计引物必须为特异性引物，一对引物只能扩增出相应病毒的序列片段，并且与其它引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构；所述设计的引物序列为：CSFV的特异性引物：F:5′-TGCAACTGAATGACGGGAC-3′R:5′-GCCAAATACCTCCTACTGACCAC-3′PPV的特异性引物：F:5′-AAAAACAATCCACCAGGACAAC-3′R:5′-CTGGATCTCATTTTTGCTGTGA-3′PRRSV的特异性引物：F:5′-CGGGCGGTATGTCCTAAGTA-3′R:5′-ACCTCAACTTTGCCCCTTTT-3′JEV的特异性引物：F:5′-AGCTTGTTGGACGGCAGAG-3′R:5′-GCCACATGATTGAGCCTTCA-3′。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：李文刚，刘胜利，李文鹏，吕玉金，吴凤笋，刘玲玲，
申请(专利权)人：河南牧业经济学院，
类型：发明
国别省市：河南,41