The invention relates to the technical field of aquaculture, in particular the reverse transcriptase polymerase chain reaction detection kit for the Cyprinus Cyprinus viremia virus, the rapid detection kit for the reverse transcription polymerase chain reaction of the Cyprinus Cyprinus viremia virus, which comprises 5 * reverse transcriptase buffer, a reverse transcriptase, a random primer; 2 The optimum design of the upper and lower primers, the Taq DNA polymerase, the positive control solution, the negative control solution, the ddH2O, overcame the deficiency of the existing detection methods of the current Cyprinus viremia virus, and provided a new type of rapid detection kit and detection method for the reverse transcription polymerase chain reaction. The clinical diagnosis of Cyprinus carpio spring virus is not only feasible, but also has the advantages of rapid, accurate and specific. It meets the requirements of clinical diagnosis and provides convenient conditions for the detection of Cyprinus Cyprinus viremia virus.
【技术实现步骤摘要】
鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于水产养殖
,涉及一种鲤春病毒血症病毒的检测方法,特别是一种采用逆转录-聚合酶链式反应(简称RT-PCR)技术检测鲤春病毒血症病毒的方法。
技术介绍
鲤春病毒血症是一种由弹状病毒科水泡病毒属的鲤春病毒血症病毒(SpringViremiaofCarpVirus,SVCV)引起的疫病,该病主要在欧洲的鲤鱼养殖中广泛传播,并造成了巨大的经济损失,是世界动物卫生组织(OIE)规定的需要向OIE申报的疫病之一。近年来,我们对鲤鱼病害的调查了解发现,SVCV在我国养殖的鲤鱼中也存在流行。SVCV病毒粒子呈弹状,为弹状病毒典型的形态学特征,大小为(90-180)nm×(60-90)nm,基因组长度为11019个核苷酸。鲤鱼是SVCV最易感的宿主。受感染鱼的临床症状表现为体色发黑,腹部膨大,鳃丝苍白,眼球突出,肛门红肿,皮肤、鳃和眼球常有出血斑点。解剖可见体内出血、腹膜炎以及出现腹水,肠道严重发炎,其他内脏上也有出血斑点,其中以鳔最为常见。该疾病的暴发取决于水温、鱼类的年龄和生理状态、种群密度以及生长压力因子等。水温是SVCV感染的关键环境因素,高死亡率发生在水温10-17℃时,但当水温17℃以上时,鱼苗和成鱼很少发生显性感染。为了尽早以及在隐性感染阶段发现养殖鲤鱼是否被SVCV感染,有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。传统诊断鲤春病毒血症病毒的方法是进行病毒分离,细胞培养,电镜观察以及免疫检测等方法,缺乏对病毒进行快速、准确、敏感的检测方法。PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点,正逐步应 ...
【技术保护点】
鲤春病毒血症病毒RT‑PCR检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:(1)5×逆转录缓冲液(2)逆转录酶(3)随机引物(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液,包含以下成分:KClMgCl2Tris‑HCl,pH5.8dNTP(5)优选的特异性检测引物:根据鲤春病毒血症病毒的核酸序列,设计用于检测鲤春病毒血症病毒的特异性检测引物,通过对所设计的引物对进行试验筛选,筛选出对鲤春病毒血症病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物,上游引物P1:5’‑GTGATTACAGATGGTACGGAC‑3’,下游引物P2:5’‑GCCAAATAACTCAAATCCACT‑3’;(6)Taq DNA聚合酶(7)灭菌的ddH2O(8)阳性对照液:提取鲤春病毒血症病毒总RNA,逆转录获得cDNA,然后以cDNA为模板,以Pl、P2为引物,进行PCR扩增,将纯化回收的扩增产物连接到pMD18‑T载体,以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照;(9)阴性对照液:以ddH2O作为阴性对照。
【技术特征摘要】
1.鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:(1)5×逆转录缓冲液(2)逆转录酶(3)随机引物(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液,包含以下成分:KClMgCl2Tris-HCl,pH5.8dNTP(5)优选的特异性检测引物:根据鲤春病毒血症病毒的核酸序列,设计用于检测鲤春病毒血症病毒的特异性检测引物,通过对所设计的引物对进行试验筛选,筛选出对鲤春病毒血症病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物,上游引物P1:5’-GTGATTACAGATGGTACGGAC-3’,下游引物P2:5’-GCCAAATAACTCAAATCCACT-3’;(6)TaqDNA聚合酶(7)灭菌的ddH2O(8)阳性对照液:提取鲤春病毒血症病毒总RNA,逆转录获得cDNA,然后以cDNA为模板,以Pl、P2为引物,进行PCR扩增,将纯化回收的扩增产物连接到pMD18-T载体,以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照;(9)阴性对照液:以ddH2O作为阴性对照。2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,采用试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法为:(1)待测样品RNA的提取:解剖待检测的鱼样品,取肝、脾、肾等组织进行匀浆,采用传统的Trizol法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA,用ddH2O溶解,即为试验用RNA模板;(2)逆转录合成cDNA:取待测样品的...
【专利技术属性】
技术研发人员:雷燕,肖洋,王娟,张文文,卢刚,马家好,
申请(专利权)人:广州利洋水产科技股份有限公司,
类型:发明
国别省市:广东,44
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