番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量PCR检测引物制造技术

本发明专利技术提供一种番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，其中，MDPV引物序列如下：上游引物P1：TAATGGTGGCAGGAATGCACAGTTC，下游引物P2：TGTTACCATGATGTCTGAAAT；GPV引物序列如下：上游引物P3：GAGGTAGACAGCAACAGAAA，下游引物P4：GCTCGTCCGTGACCATA。目前，还没有基于SYBR Green II的双重实时荧光定量PCR检测引物及方法可以同时将GPV各种基因亚型完全地和MDPV区分开来的相关研究报道和发明专利技术专利，本发明专利技术的建立可填补相关领域空白。

Dual real-time fluorescence quantitative PCR primers for detection of Muscovy Duck Parvovirus and goose parvovirus

The invention provides a dual real-time fluorescence quantitative PCR detection primer for the Muscovy Duck Parvovirus (MDPV) and the goose parvovirus (GPV), in which the sequence of MDPV primers is as follows: the upstream primer P1:TAATGGTGGCAGGAATGCACAGTTC, the downstream primer P2:TGTTACCATGATGTCTGAAAT, and the sequence of GPV primers as follows: the upstream primer P3:GAGGTAGACAG CAACAGAAA, downstream primer P4:GCTCGTCCGTGACCATA. At present, there is no SYBR based Green II based dual real-time quantitative PCR detection primers and methods that can simultaneously separate the GPV gene subtypes from MDPV and invent a patent. The establishment of this invention can fill the gap in the related fields.

【技术实现步骤摘要】
番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量PCR检测引物
本专利技术属于预防兽医学领域，涉及番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，具体涉及用于MDPV和GPV多重SYBRGreenII实时荧光定量PCR方法的引物及方法。
技术介绍
番鸭细小病毒(Muscovyduckparvovirus，MDPV)是引起雏番鸭以腹泻、软脚和呼吸困难为主要症状的雏番鸭疫病（俗称“三周病”）的病原，主要引起3周龄以内雏番鸭发病，发病率为27%～62%，病死率为22%～43%，是危害番鸭养殖的重要病原。该病最早由我国学者程由铨于1988年在世界首次分离鉴定到MDPV，随后法国、美国、日本等地相继报道了本病的流行。鹅细小病毒（Goslingparvovirus，GPV）也称小鹅瘟病毒，是引起雏鹅和雏番鸭的一种高度接触性、急性败血性传染病（小鹅瘟，GoslingPlague）的病原。该病最早由我国学者方定一于1956年在江苏扬州发病鹅群中发现，并在世界首次分离到GPV。该病发病率和死亡率高，且传播速度快，是对养鹅业产生严重危害的一种重要传染病。近十多年来，GPV出现了新的变异株，如1997年以来在我国番鸭群暴发流行一种新基因亚型MDGPV(代表株GPVPT株)；2015年以来在我国半番鸭、樱桃谷鸭群暴发流行一种以短喙长舌易骨折生长障碍为特征的疫病，其病原为不同于GPV和GPVPT株的新型GPV（称为SBDS-GPV）MDPV和GPV在分类学上均为细小病毒科依赖病毒属成员。两者在形态结构上难以鉴别，在基因组序列上高度同源。MDPV和GPV基因组核苷酸以及推导氨基酸序列同源性分别为81.9%和88.9%，因而临床鉴别诊断难度较大，普通PCR诊断方法很难鉴别诊断。SYBRGreenII实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物，使用实时监测的荧光定量PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、灵敏度高、定量准确、适用性广等优点。双重SYBRGreenII实时荧光定量PCR是在单重实时荧光定量PCR的基础上，利用2组引物扩增的目的片段其GC含量的差异所导致的Tm值差异，在SYBRGreenII实时荧光定量PCR反应完成后结合熔解曲线峰值的差异来对MDPV和GPV进行快速鉴别诊断和病毒载量分析。目前，尽管针对MDPV和GPV的荧光定量PCR检测方法均有报道，也包括同时可以检测MDPV和GPV的单管双重荧光定量PCR鉴别方法。但由于近年来我国番鸭群中流行的新基因亚型GPV（MDGPV），与经典GPV和MDPV都有较高的同源性，导致用现有的双重荧光定量PCR方法鉴别时往往将它误判为MDPV。目前还没有一套可以同时将GPV各种基因亚型完全地和MDPV区分开来的双重荧光定量PCR检测引物及方法，本专利技术的建立可填补相关领域空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，利用2组引物扩增的目的片段其GC含量的差异所导致的Tm值差异，在SYBRGreenII实时荧光定量PCR反应完成后结合熔解曲线峰值的差异来对MDPV和GPV进行快速鉴别诊断和病毒载量分析。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）双重实时荧光定量PCR检测引物，所述双重SYBRGreenII实时荧光定量PCR检测引物，其中，MDPV引物序列如下：上游引物P1：TAATGGTGGCAGGAATGCACAGTTC，下游引物P2：TGTTACCATGATGTCTGAAAT；GPV引物序列如下：上游引物P3：GAGGTAGACAGCAACAGAAA，下游引物P4：GCTCGTCCGTGACCATA。所述的双重实时荧光定量PCR扩增条件为：SYBR®PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)10μL、MDPV上/下游引物10μM各0.5μL、GPV上/下游引物10μM各0.5μL、MDPV/GPV模板分别为1μL、补充灭菌去离子水至终体积20μL；反应条件为：95℃，5min预变性；95℃15s、60℃10s、72℃15s，共40个循环；反应结束后，做出熔解曲线。本专利技术的优点在于：本专利技术根据NCBI中的番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）基因组序列，建立检测MDPV和GPV的双重实时荧光定量PCR方法，该方法敏感性高、特异性强、重复性好，可同时鉴别检测MDPV和GPV，特别是能将包括GPV新基因亚型在内的GPV各种型别较好地与MDPV进行区分，为研究MDPV和GPV共感染提供可靠的检测手段。附图说明图1MDPV标准曲线的建立。图2GPV标准曲线的建立。图3熔解曲线的建立。图4实时荧光定量PCR特异性试验。图5MDPV和GPV的鉴别检测，其中A为本专利技术方法检测结果，B为现有双重荧光定量PCR方法的检测结果。具体实施方式1.1材料1.1.1病毒株番鸭细小病毒（MDPV）、鹅细小病毒包括经典GPV-SG株（GPV1）、MDGPVPT株(GPV2)和SBDS-GPVM15株（GPV3）、新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭瘟病毒(DPV)和鹅副粘病毒(PMV)，均由本研究室分离鉴定并保存；减蛋综合症病毒(EDSV)购自中国兽药监察所；病毒DNA按常规方法提取。1.1.2主要仪器和试剂SYBR®PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)、pMD19-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司、DNase/RNase-Free去离子水(RT121)购自天根生化科技（北京）有限公司；Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；荧光定量PCR八连排透明PCR薄壁管购自Axygen。1.2方法1.2.1引物设计及合成参考GenBank中登录的MDPV和GPV基因组特征，利用DNAMANVersion8软件进行同源性分析比较，选出保守且特异的核苷酸区域，利用引物设计软件PrimerPremierVersion5设计引物（引物序列见表1），采用BLAST工具进行检索，验证其特异性，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表1MDPV和GPV实时荧光定量引物1.2.2阳性标准品的制备1.2.1中选取的核苷酸序列送生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成并连接至pMD19-T载体，重组质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。测序结果表明该阳性重组质粒符合预期，即做为MDPV和GPV实时荧光定量PCR的阳性标准品Mp1和Gda1，根据核酸浓度和分子量分别计算标准品拷贝数。1.2.3MDPV和GPV双重荧光定量PCR检测方法的建立1.2.3.1反应条件的优化采用SYBR®PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)推荐的20μL反应体系，以出现最高的荧光值（△Rn）、最小的Ct值以及在熔解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，对退火温度（52～65℃）进行优化。循环结束后，绘制熔解曲线。1.2.3.2标准曲线的建立将阳性标准品Mp1和Gda1利用DNase/RNase-Free去离子水本文档来自技高网...

【技术保护点】
番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于：所述引物包含两对引物，其中，MDPV引物序列如下：上游引物P1：TAATGGTGGCAGGAATGCACAGTTC，下游引物P2：TGTTACCATGATGTCTGAAAT；GPV引物序列如下：上游引物P3：GAGGTAGACAGCAACAGAAA，下游引物P4：GCTCGTCCGTGACCATA。

【技术特征摘要】
1.番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于：所述引物包含两对引物，其中，MDPV引物序列如下：上游引物P1：TAATGGTGGCAGGAATGCACAGTTC，下游引物P2：TGTTACCATGATGTCTGAAAT；GPV引物序列如下：上游引物P3：GAGGTAGACAGCAACAGAAA，下游引物P4：GCTCGTCCGTGACCATA。2.如权利要求1所述的引物用于番...

【专利技术属性】
技术研发人员：林甦，陈少莺，王劭，黄梅清，程晓霞，俞博，肖世峰，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35