本发明专利技术公开了一种一管PCR式鉴别诊断鹅细小病毒(Goose?parvovirus，GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy?duck?parvovirus，MDPV)的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明，其中所述引物为SEQ?ID?NOs：1-3。本发明专利技术的试剂盒适合鉴定鹅或番鸭动物的肝、脾和肾脏组织样品、泄殖腔棉拭子、鸭或鹅胚尿囊液以及细胞培养物样品中的GPV和MDPV。所述试剂盒在使用时包括下述步骤：(1)从待检鹅或番鸭动物获取待检样品，并对待检样品提取基因组DNA；(2)将步骤(1)获得的待检样品的基因组DNA与三种引物SEQ?ID?NOs：1-3一起以适量放置在一个PCR管中，进行PCR反应；和(3)电泳检测PCR产物，并根据PCR产物大小鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒，其中约700bp的特异性DNA条带表示存在鹅细小病毒，约300bp的特异性DNA条带表示存在番鸭细小病毒，同时存在约700bp和约300bp的条带表示同时存在鹅细小病毒和番鸭细小病毒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学
，涉及一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明，其中所述引物为SEQ ID NOs:l-30本专利技术还提供SEQ ID NOs: 1_3所示的引物在制备一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒中的应用。
技术介绍
鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)可引起雏鹅急性或亚急性败血性传染病，它不仅侵害雏鹅和4-8周龄小鹅，也感染雏番鸭，危害极为严重；番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus, MDPV)引起并且以雏番鸭为易感群体的一种急性传染性病毒病，临床表现为腹泻、呼吸困难、脚软、渗出性肠炎等，死亡率和发病率都很高。GPV和MDPV在理化特性、形态结构包括基因组结构以及免疫学特性等方面非常接近，但二者在致病性上却有较大差异=MDPV只能感染番鸭及番鸭源细胞，GPV既能感染鹅又可以感染番鸭及其体外培养细胞。二者均属于细小病毒科细小病毒属，在形态上难以鉴别，同时在血清学上又有交叉反应，目前急需一种特异性强、快速灵敏且能够区分这两种疾病的诊断方法。NS蛋白为病毒的非结构蛋白，在进化过程中较为保守，主要参与DNA的复制和转录的调节。根据GenBank中GPV和MDPV NS基因序列保守区设计I个通用上游引物，在根据GPV和MDPV毒株序列各自特异性保守区设计两个下游引物；获得扩增片段为部分NS2蛋白的基因序列，根据扩增片断长短不同进而达到快速鉴别感染病毒GPV和MDPV的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过一管PCR来鉴别鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus, MDPV)。为实现上述目的，本专利技术提供一种一管PCR式鉴别诊断鹅细小病毒(Gooseparvovirus,GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明。本研究在引物设计过程中充分考虑了引物的普适性，包括了 GenBank中所有的国家和地区的代表性毒株。例如，GPV病毒包括了匈牙利、德国、中国和台湾地区，病毒分离株时间跨度为30余年(1960s年代至-2009年)。由于GenBank MDPV病毒只有中国和匈牙利报道过3个毒株，时间跨度为1988年至1996年间的代表性毒株。GPV和MDPV的NS基因具有细小病毒普遍存在的高度保守区，和针对不同型病毒特异性保守区；根据GenBank收录的GPV和MDPV 的NS基因保守区(见附图说明图1、图2、图3)，设计合成了 3个特异性引物。其中上游引物依据GPV和MDPV高度保守区设计了 GPV和MDPV的通用引物p⑶P:5’ CTATTGCCCATGCTGTACCCTTCTATGGCTG3’(图 1，SEQ ID NO:1)，p⑶P 引物序列对于 GPV 和 MDPV都高度保守，表明该引物序列可用于GPV和MDPV毒株的PCR扩增；另外根据GPV和MDPV各自毒株序列的特异性分别合成了各自的下游特异性引物=MDPV的下游引物为pDPR:5’CCTTCCAGCTTATGGGAAAGA3’(图2，SEQ ID NO:2)，引物序列对于MDPV毒株高度保守，但对于GPV则差异性较大，因此该引物序列只适用于MDPV的PCR扩增；GPV的下游引物为pGPR:5’ ACATCCATAGAATTGTCATAAG3’ (图 3，SEQ ID NO:3)，引物序列对于 GPV 毒株高度保守，而对于MDPV则差异性较大，表明该引物只适用于GPV毒株的PCR扩增检测，不能扩增或检测MDPV毒株。因此，该3对引物可以用于GPV和MDPV的鉴别诊断。表1.引物设计所用番鸭和鹅细小病毒信肩权利要求1.一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明，其中所述引物为SEQ ID N0s:l-3。2.根据权利要求I所述的试剂盒，其中所述待检样品为待检鹅或番鸭动物的肝脏、脾脏、棉拭子、鸭或鹅胚尿囊液以及细胞培养物。3.根据权利要求I所述的试剂盒，其中所述处理待检样品的试剂是基因组DNA提取试剂。4.根据权利要求I所述的试剂盒，其中SEQID NO :1为关于鹅细小病毒和番鸭细小病毒通用的上游引物，SEQ ID NO :2为对番鸭细小病毒特异性的下游引物，SEQ ID NO :3为对鹅细小病毒特异性的下游引物。5.根据权利要求I所述的试剂盒，其中在使用时包括下述步骤 (1)从待检鹅或番鸭动物肝脏、脾脏、棉拭子、鸭或鹅胚尿囊液以及细胞培养物获取待检样品，并对待检样品提取基因组DNA ； (2)将步骤(I)获得的待检样品的基因组DNA与三种引物SEQID NOs :1_3 —起以适量放置在一个PCR管中，进行PCR反应；和 (3)电泳检测PCR产物，并根据PCR产物鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒， 其中约700bp的特异性DNA条带表示存在鹅细小病毒，约300bp的特异性DNA条带表示存在番鸭细小病毒，同时存在约700bp和约300bp的条带表示同时存在鹅细小病毒和番鸭细小病毒。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中PCR反应程序为94°C预变性3min;94°C变性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸lmin, 25个循环；最后72°C延伸7min。7.SEQ ID NOs :1-3所示的引物在制备一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒中的应用。8.—管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的方法，所述方法包括下述步骤 (1)从待检鶴或番鸭动物获取待检样品，并对待检样品提取基因组DNA； (2)将步骤(I)获得的待检样品的基因组DNA与三种引物SEQID NOs :1_3 —起以适量放置在一个PCR管中，进行PCR反应；和 (3)电泳检测PCR产物，并根据PCR产物鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒， 其中约700bp的特异性DNA条带表示存在鹅细小病毒，约300bp的特异性DNA条带表示存在番鸭细小病毒，同时存在约700bp和约300bp的条带表示同时存在鹅细小病毒和番鸭细小病毒。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述待检样品取自鹅或番鸭动物的肝脏、脾脏、棉拭子、鸭或鹅胚尿囊液以及细胞培养物。10.根据权利要求8所述的方法，其中PCR反应程序为94°C预变性3min;94°C变性30s，55°C退火30s, 72°C延伸lmin, 25个循环；最后72°C延伸7min。全文摘要本专利技术公开了一种一管PCR式鉴别诊断鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明，其中所述引物为SEQ ID NOs1-3。本专利技术的试剂盒适合鉴定鹅或番鸭动物的肝、脾和肾脏组织样品、泄殖腔棉拭子、鸭或鹅胚尿囊液以及细胞培养物样品中的GPV和MDPV。所述试剂盒在使用时包括下述步骤(1)从本文档来自技高网...
【技术保护点】
一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明，其中所述引物为SEQ?ID?NOs：1?3。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张云，刘明，殷秀臣，刘红玉，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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