一种罗湖病毒Taq-man探针荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种罗湖病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括RT‑PCR反应液、Taq酶、逆转录酶、罗湖病毒荧光定量反应液以及无RNA酶的去离子水；所述的罗湖病毒荧光定量反应液包括两条检测罗湖病毒的引物和一条检测罗湖病毒的探针，所述的检测罗湖病毒的探针在其5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。本发明专利技术检测试剂盒(1)具有高度的特异性，其只能扩增出罗湖病毒的核酸，而不与其它病原核酸发生交叉反应的特点；(2)对于罗湖病毒的诊断具有高度的灵敏性；(3)检测结果准确度高，检测速度快。

A fluorescent quantitative PCR detection kit for Taq-man probe of Luohu virus and its detection method

The present invention relates to a Luohu virus fluorescent quantitative PCR detection kit, including the RT PCR reaction liquid, the Taq enzyme, the reverse transcriptase, the fluorescent quantitative reaction liquid of the Luohu virus, and the deionized water without the RNA enzyme; the Luohu virus fluorescent quantitative reacting fluid includes two primers for the detection of the Luohu virus and a probe for the detection of the Luohu virus The probes for detection of Luohu virus are labeled with fluorescent reporter groups at the 5'end, and fluorescent quenching groups are marked at 3' terminals. The detection kit (1) of the invention has high specificity, which can only amplify the nucleic acid of Luohu virus and not cross reaction with other pathogenic nucleic acids; (2) it has high sensitivity for the diagnosis of Luohu virus; (3) the accuracy of the detection results is high, and the detection speed is fast.

【技术实现步骤摘要】
一种罗湖病毒Taq-man探针荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及鱼类病毒体外检测技术，尤其涉及罗湖病毒荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，其属于病毒分子生物学领域。
技术介绍
从2000年至今，我国罗非鱼养殖量一直居世界第一，近年来，我国罗非鱼养殖产量仍保持增长态势，2015年总产量约178万t，约占全球总产量的30％。罗非鱼产业作为我国出口导向型产业，主要依靠出口贸易来维持产业运转。国内共有133家罗非鱼加工出口企业，总出口量约40万吨，销往97个国家和地区。2002年开始我国罗非鱼的出口量与出口额基本都呈持续增长的态势，2005年罗非鱼出口量为10.74万吨，2009年为25.89万吨，2013年为40.67万吨，创下历史最高水平，总出口额为15.13亿美元。罗非鱼养殖已成为我国出口创汇和渔民增收的重要途径。然而，近年来以色列、厄瓜多尔和埃及等国相继暴发的与病毒有关的养殖和野生罗非鱼大量死亡事件，给这些国家的罗非鱼养殖业造成了重大损失。经研究发现引起这些死鱼事件的病原均为罗湖病毒(Tilapialakevirus，TiLV)，是一种新型鱼RNA病毒。从以色列和厄瓜多尔死鱼事件中病鱼的肝、脑病灶中均发现病毒核酸，同时观察到由病鱼组织分离到的TiLV在培养细胞中繁殖后，接种到健康鱼体内后，可产生相同症状的疾病，提示TiLV为以色列和厄瓜多尔死鱼事件的病因。以色列和埃及两国相邻，但另一个地理上相隔甚远的南美国家厄瓜多尔也发生了由同种病毒引起死鱼事也发生了由TiLV导致的大规模死鱼事件，说明该病毒已经对全球性罗非鱼养殖业造成了威胁。罗湖病毒病是近几年新出现的一种高致病性和高死亡率的罗非鱼病毒病，病原为罗湖病毒(Tilapialakevirus，TiLV)，感染该病毒的罗非鱼死亡率高达90％以上，TiLV为正粘样病毒科，负链RNA病毒，基因组分为10个节段。截止目前为止，厄瓜多尔、以色列、哥伦比亚、埃及、泰国等多个国家和区域均由此病爆发的报道，中国目前虽然未见罗湖病毒病的相关报道，但多地爆发的罗非鱼病害，其症状与罗湖病毒病及其相似，并且已检测出TiLV，但国内罗湖病毒的流行情况还完全未知。针对TiLV的检测方法，有巢式和半巢式RT-PCR，和原位杂交，这些检测方法操作过程均较为复杂，耗时长，需要特定的仪器设备，且巢式和半巢式RT-PCR的假阳性率比较高，因此，已有的这些检测方法都不适用于罗湖病毒的高效、快速检测，更无法对病毒进行定量分析。实时荧光定量PCR技术(Real-timequantitativePolymeraseChainReaction，RealTimePCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Appliedbiosystems公司推出，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(cDNA)的起始浓度进行定量的方法。如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时PCR即(Real-timeRT-PCR)是实时PCR法，它是指对DNA或经过反转录(RT-PCR)的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA(RNA)起始量存在相关性，从而实现定量检测。RealTimePCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏性和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。此外，通过在该体系中加入两条或者两条以上引物及对应的探针，便可实现对多种病原体的同时检测。因此，建立TiLV荧光定量快速检测的技术，不仅可以做到对罗湖病毒进行鉴别诊断和定量分析，而且可以简化操作程序、节约成本。对于罗湖病毒病的流行病学调查、病原监测及早期预警都具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种能同时检测和定量分析罗湖病毒的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，该试剂盒和检测方法敏感性强，特异性高，可以快速、准确的对TiLV进行诊断、定量分析和病原鉴定。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种罗湖病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括RT-PCR反应液、Taq酶、逆转录酶、罗湖病毒荧光定量反应液以及无RNA酶的去离子水；其中，所述的罗湖病毒荧光定量反应液包括两条检测罗湖病毒的引物和一条检测罗湖病毒的探针，所述的两条检测罗湖病毒的引物的序列分别为：上游引物TiLV-PFSeqNo.1：5'GACTGCAGCTATGTTATCTGG3'；下游引物TiLV-PRSeqNo.2：5'TGGTGTAAGTGGGGTTGTT3'；所述的检测罗湖病毒的探针的序列如下：探针TiLV-PSeqNo.3：5'AAGCAGCAGGAATGTGCCTAT3'；所述的检测罗湖病毒的探针在其5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。进一步地，所述罗湖病毒荧光定量PCR检测试剂盒中包括RT-PCR反应液12.5μL，Taq酶0.5μL，逆转录酶0.5μL，罗湖病毒荧光定量反应液4μL，无RNA酶的去离子水2.5μL。进一步地，所述罗湖病毒荧光定量反应液为将5μL的100uM上游引物TiLV-PF、5μL的100uM下游引物TiLV-PR以及4μL的100uM探针引物TiLV-P加入169μL无RNA酶的去离子水中制得。本专利技术对上述引物和探针的配比比例进行了试验，它们之间不同的配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，当上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果：检测罗湖病毒的引物及探针之间的配比分别为：SeqNo.1：SeqNo.2：SeqNo.3＝5：5：4。进一步地，所述的荧光报告基团为FAM、HEX、ROX、CY3或CY5；所述的荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3。进一步地，所述的逆转录酶为M-MLV逆转录酶，所述的Taq酶为热启动Taq酶。本专利技术的罗湖病毒荧光定量PCR检测试剂盒中还含有罗湖病毒的阳性对照参考品：灭活的罗湖病毒TiLV-ZJ1710株的培养液。本专利技术的罗湖病毒荧光定量PCR检测试剂盒中还含有阴性对照参考品：无RNA的去离子水。本专利技术还提出了一种罗湖病毒荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：S1：提取待测样品鱼RNA；S2：试剂配制在每个PCR反应管放入如下组分：其中，所述的罗湖病毒荧光定量反应液包括两条检测罗湖病毒的引物和一条检测罗湖病毒的探针，且罗湖病毒荧光定量反应液按照下表配置：名称加入量(μL)100uMTiLV-PF5100uMTiLV-PR5100uMTiLV-P4无RNA酶去离子水169所述的两条检测罗湖病毒的引物的序列分别为：TiLV-PFSeqNo.1：5'GACTGCAGCTATGTTATCTGG3'；TiLV-PRSeqNo.2：5'TGGTGTAAGTGGGGTTGTT3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种罗湖病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括RT‑PCR反应液、Taq酶、逆转录酶、罗湖病毒荧光定量反应液以及无RNA酶的去离子水；其中，所述的罗湖病毒荧光定量反应液包括两条检测罗湖病毒的引物和一条检测罗湖病毒的探针，所述的两条检测罗湖病毒的引物的序列分别为：上游引物TiLV‑PF Seq No.1：5'GAC TGC AGC TAT GTT ATC TGG 3'；下游引物TiLV‑PR Seq No.2：5'TGG TGT AAG TGG GGT TGT T 3'；所述的检测罗湖病毒的探针的序列如下：探针TiLV‑P Seq No.3：5'AAG CAG CAG GAA TGT GCC TAT3'；所述的检测罗湖病毒的探针在其5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种罗湖病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括RT-PCR反应液、Taq酶、逆转录酶、罗湖病毒荧光定量反应液以及无RNA酶的去离子水；其中，所述的罗湖病毒荧光定量反应液包括两条检测罗湖病毒的引物和一条检测罗湖病毒的探针，所述的两条检测罗湖病毒的引物的序列分别为：上游引物TiLV-PFSeqNo.1：5'GACTGCAGCTATGTTATCTGG3'；下游引物TiLV-PRSeqNo.2：5'TGGTGTAAGTGGGGTTGTT3'；所述的检测罗湖病毒的探针的序列如下：探针TiLV-PSeqNo.3：5'AAGCAGCAGGAATGTGCCTAT3'；所述的检测罗湖病毒的探针在其5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述罗湖病毒荧光定量PCR检测试剂盒中包括RT-PCR反应液12.5μL，Taq酶0.5μL，逆转录酶0.5μL，罗湖病毒荧光定量反应液4μL，无RNA酶的去离子水2.5μL。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述罗湖病毒荧光定量反应液为将5μL的100uM上游引物TiLV-PF、5μL的100uM下游引物TiLV-PR以及4μL的100uM探针引物TiLV-P加入169μL无RNA酶的去离子水中制得。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM、HEX、ROX、CY3或者CY5；所述的荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2或者BHQ3。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的逆...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾伟伟，王庆，王英英，尹纪元，张德锋，李莹莹，汤亚方，任燕，石存斌，刘春，常藕勤，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44