一种罗湖病毒的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种罗湖病毒的RT‑LAMP检测引物组、试剂盒及方法。本发明专利技术试剂盒包括RT‑LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、荧光染料，RT‑LAMP引物组，蒸馏水，阳性和阴性对照样品；所述的RT‑LAMP组由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成。本发明专利技术罗湖病毒RT‑LAMP检测试剂盒具有操作简便、特异性强、灵敏度高、快速准确等特点，非常适用于出口检疫及养殖场的现场检测，易于大规模推广应用。

A primer set, kit and method for RT-LAMP detection of Luohu virus

The invention discloses a RT LAMP detection primer set, a kit and a method for Luohu virus. The kit includes the RT LAMP reaction liquid, the Bst DNA polymerase, the AMV reverse transcriptase, the fluorescent dye, the RT LAMP primer group, the distilled water, the positive and negative control samples; the RT LAMP group is composed of one external primer, one pair of primers and a pair of ring primers. The Luohu virus RT LAMP detection kit has the advantages of simple operation, strong specificity, high sensitivity, fast and accurate and so on. It is very suitable for the field inspection of export and quarantine and breeding farms, and is easy to be popularized in large scale.

【技术实现步骤摘要】
一种罗湖病毒的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及方法
本专利技术属于病毒分子生物学领域，具体涉及一种罗湖病毒的RT-LAMP可视化快速检测试剂盒，更具体涉及一种罗湖病毒的RT-LAMP引物组、检测方法及其可视化快速检测试剂盒。
技术介绍
从2000年至今，我国罗非鱼养殖量一直居世界第一，近年来，我国罗非鱼养殖产量仍保持增长态势，2015年总产量约178万t，约占全球总产量的30％。罗非鱼产业作为我国出口导向型产业，主要依靠出口贸易来维持产业运转。国内共有133家罗非鱼加工出口企业，总出口量约40万吨，销往97个国家和地区。2002年开始我国罗非鱼的出口量与出口额基本都呈持续增长的态势，2005年罗非鱼出口量为10.74万吨，2009年为25.89万吨，2013年为40.67万吨，创下历史最高水平，总出口额为15.13亿美元。罗非鱼养殖已成为我国出口创汇和渔民增收的重要途径。然而，近年来以色列、厄瓜多尔和埃及等国相继暴发的与病毒有关的养殖和野生罗非鱼大量死亡事件，给这些国家的罗非鱼养殖业造成了重大损失。经研究发现引起这些死鱼事件的病原均为罗湖病毒(Tilapialakevirus，TiLV)，是一种新型鱼RNA病毒。从以色列和厄瓜多尔死鱼事件中病鱼的肝、脑病灶中均发现病毒核酸，同时观察到由病鱼组织分离到的TiLV在培养细胞中繁殖后，接种到健康鱼体内后，可产生相同症状的疾病，提示TiLV为以色列和厄瓜多尔死鱼事件的病因。以色列和埃及两国相邻，但另一个地理上相隔甚远的南美国家厄瓜多尔也发生了由同种病毒引起死鱼事也发生了由TiLV导致的大规模死鱼事件，说明该病毒已经对全球性罗非鱼养殖业造成了威胁。罗湖病毒病是近几年新出现的一种高致病性和高死亡率的罗非鱼病毒病，病原为罗湖病毒(Tilapialakevirus，TiLV)，感染该病毒的罗非鱼死亡率高达90％以上，TiLV为正粘样病毒科，负链RNA病毒，基因组分为10个节段。截止目前为止，厄瓜多尔、以色列、哥伦比亚、埃及、泰国等多个国家和区域均由此病爆发的报道，中国目前虽然未见罗湖病毒病的相关报道，但多地爆发的罗非鱼病害，其症状与罗湖病毒病及其相似，并且已检测出TiLV，但国内罗湖病毒的流行情况还完全未知。针对TiLV的检测方法，有巢式和半巢式RT-PCR，和原位杂交，这些检测方法操作过程均较为复杂，耗时长，需要特定的仪器设备，且巢式和半巢式RT-PCR的假阳性率比较高，因此，已有的这些检测方法都不适用于罗湖病毒的高效、快速现场检测。LAMP技术是2000年由日本学者Notomi等专利技术的一种恒温扩增方法，它通过针对靶基因的6个区域而设计4对特异性引物，只有在引物与靶序列结合扩增反应才能进行，特异性很高。在60-65℃等温条件下利用链置换DNA聚合酶催化几十分钟就可以扩增出109靶序列拷贝。相对于传统的核酸扩增方法，LAMP法扩增克服了需要昂贵仪器的特点，整个检测过程在等温条件下只需要1-2个小时就可以完成；该方法还具有很高的敏感性和特异性，且在反应体系中加入染料之后可以通过肉眼观察颜色的变化就能进行结果判定。该技术自产生之后已经在转基因食品检测、动物疫病诊断及动物胚胎的性别鉴定等领域得到广泛的推广及应用。LAMP适合基层养殖户及出入境检疫对病原进行快速检测。因此，建立TiLV的RT-LAMP快速检测的技术，不仅可以做到对罗湖病毒进行快速检测，而且可以简化操作程序、节约成本。对于罗湖病毒病的流行病学调查、病原监测及早期预警都具有重要的意义。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术提供了一种罗湖病毒的RT-LAMP可视化快速检测试剂盒，在罗湖病毒特异性检测中，使用RT-LAMP检测试剂盒完成对罗湖病毒的特异性检测，通过反应产物中加入荧光染料后的颜色变化来判断被测样品是否含有TiLV。本专利技术的目的之一在于提供一种罗湖病毒的RT-LAMP检测引物组。本专利技术的另一目的在于提供一种罗湖病毒的RT-LAMP检测试剂盒。本专利技术的再一目的在于提供一种罗湖病毒的RT-LAMP检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种检测罗湖病毒的RT-LAMP引物组，所述RT-LAMP引物组包括外引物、内引物和环引物，具体序列如下：外引物：TiLV-FIP：5’-CTTCTGCGAGTCTTTGAGGCACCTGATGGCCCAGACACTA-3’(SEQIDNO：1)；TiLV-BIP:5’-AGAACCCGACTAGAGGCTCTCTCTGACACGAGGAGCCTATG-3’(SEQIDNO：2)；内引物：TiLV-F3：5’-CTGACTTGGGATTGCCACC-3(SEQIDNO：3)；TiLV-B3：5’-TGCCTAGCTGCTCTGATCT-3(SEQIDNO：4)；环引物：TiLV-LF：5’-AGGACAGACAGGACTTTCTGATC-3(SEQIDNO：5)；TiLV-LB：5’-CAGACTTGGACCCCCTGGT-3(SEQIDNO：6)。一种检测罗湖病毒的RT-LAMP试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物组。进一步的，上述试剂盒中外引物、环引物、内引物的摩尔含量比为1:3～5:7～9。进一步的，上述试剂盒还包含RT-LAMP反应液，BstDNA聚合酶，AMV反转录酶，荧光染料，阳性和阴性对照样品。进一步的，所述RT-LAMP反应液包含23～2.7mMdNTPs、14～18mMMgSO4、1.4～1.8mM的甜菜碱、18～22mM的KCl、0.15～0.25％的Tween20、18～22mM的(HN4)2SO4、35～45mM的Tris-ClpH8.6～9.0。进一步的，所述荧光染料为钙黄绿素。进一步的，所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。一种罗湖病毒的RT-LAMP检测方法，包括如下步骤：1)提取待检样品的RNA；2)以提取的RNA为模板，用上述所述的引物组进行RT-LAMP扩增；3)结果分析：反应结束后向反应物中加入钙黄绿素染料，观察是否发生变色，如果变色为黄绿色，说明样品为阳性；或者通过电泳分析是否出现梯形条带；如果出现梯状条带，说明样品为阳性，否则为阴性；上述方法用于非疾病的诊断和治疗。进一步的，所述RT-LAMP扩增的反应体系为22～27μL，含有TiLV-FIP1.4～1.8μM、TiLV-BIP1.4～1.8μM、TiLV-F30.15～0.25μM、TiLV-LB0.15～0.25μM、TiLV-B30.6～1.0μM、TiLV-LF0.6～1.0μM，上述任一项所述的RT-LAMP反应液12～13μL、BstDNA聚合酶6～10U，AMV反转录酶3～5U，RNA模板5～100ng，余量为DEPC水。进一步的，所述RT-LAMP扩增的反应程序为62～66℃反应30～60min。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术通过对RT-LAMP条件的优化，以及敏感性，特异性试验的研究，建立了罗湖病毒的RT-LAMP诊断方法，确定了检测效果具有高特异性、高敏感性的6条引物，为罗湖病毒的现场快速诊断提供了一种简便快速的方法，该方法具有反应条件简单，结果判定方便，敏感性稿，特异性强，快速等优点。(2)本专利技术的优势还在于已经将这种RT-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测罗湖病毒的RT‑LAMP引物组，其特征在于，所述RT‑LAMP引物组包括外引物、内引物和环引物，具体序列如下：外引物：TiLV‑FIP：5’‑CTTCTGCGAGTCTTTGAGGCACCTGATGGCCCAGACACTA‑3’(SEQ ID NO：1)；TiLV‑BIP:5’‑AGAACCCGACTAGAGGCTCTCTCTGACACGAGGAGCCTATG‑3’(SEQ ID NO：2)；内引物：TiLV‑F3：5’‑CTGACTTGGGATTGCCACC‑3(SEQ ID NO：3)；TiLV‑B3：5’‑TGCCTAGCTGCTCTGATCT‑3(SEQ ID NO：4)；环引物：TiLV‑LF：5’‑AGGACAGACAGGACTTTCTGATC‑3(SEQ ID NO：5)；TiLV‑LB：5’‑CAGACTTGGACCCCCTGGT‑3(SEQ ID NO：6)。

【技术特征摘要】
1.一种检测罗湖病毒的RT-LAMP引物组，其特征在于，所述RT-LAMP引物组包括外引物、内引物和环引物，具体序列如下：外引物：TiLV-FIP：5’-CTTCTGCGAGTCTTTGAGGCACCTGATGGCCCAGACACTA-3’(SEQIDNO：1)；TiLV-BIP:5’-AGAACCCGACTAGAGGCTCTCTCTGACACGAGGAGCCTATG-3’(SEQIDNO：2)；内引物：TiLV-F3：5’-CTGACTTGGGATTGCCACC-3(SEQIDNO：3)；TiLV-B3：5’-TGCCTAGCTGCTCTGATCT-3(SEQIDNO：4)；环引物：TiLV-LF：5’-AGGACAGACAGGACTTTCTGATC-3(SEQIDNO：5)；TiLV-LB：5’-CAGACTTGGACCCCCTGGT-3(SEQIDNO：6)。2.一种检测罗湖病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中外引物、环引物、内引物的摩尔含量比为1:3～5:7～9。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包含RT-LAMP反应液，BstDNA聚合酶，AMV反转录酶，荧光染料，阳性和阴性对照样品。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述RT-LAMP反应液包含23～2.7mMdNTPs、14～18mMMgSO4、1.4～1.8mM的甜菜碱、18～2...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾伟伟，王庆，王英英，尹纪元，汤亚方，石存斌，张德峰，李莹莹，任燕，常藕勤，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44