一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂、方法及应用技术

本申请公开了一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂、方法及应用。本申请的试剂包括FMDV引物探针组和SVA引物探针组；FMDV引物探针组的上下游引物分别为Seq ID No.1和2所示序列，探针为Seq ID No.3或其反向互补序列；SVA引物探针的上下游引物分别为Seq ID No.4和5所示序列，探针为Seq IDNo.6或其反向互补序列。本申请的试剂，能同时对FMDV和SVA进行检测和鉴别，特异性强、灵敏度高，为口蹄疫病毒和猪A型塞内卡病毒的鉴别检测提供了一种高效技术手段。本申请的试剂，适用于两种疫病的快速鉴别检测。

A reagent, method and application for identification of FMDV and SVA

The application discloses a reagent, a method and an application for identifying FMDV and SVA. The reagents of this application include the FMDV primer probe group and the SVA primer probe group; the upstream and downstream primers of the FMDV primer probe group are Seq ID No.1 and 2, respectively, and the probe is Seq ID ID No.3 or its reverse complementary sequence; the upstream and downstream primers of the SVA primer probe are Seq ID, respectively and 5. To the complementary sequence. The reagents used in this application can detect and identify FMDV and SVA at the same time, and have high specificity and sensitivity. It provides a high efficient technique for the identification of foot and mouth disease virus and pig A type Seneca virus. The reagent is suitable for rapid identification of two kinds of Phytophthora blight.

【技术实现步骤摘要】
一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂、方法及应用
本申请涉及口蹄疫病毒和猪A型塞内卡病毒检测鉴别领域，特别是涉及一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂、方法及应用。
技术介绍
口蹄疫(Foot-and-mouthdisease,缩写FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,缩写FMDV)引起的一种感染猪、牛、羊等偶蹄动物的急性、热性、接触传染性动物疫病，染病动物出现高热，临床症状以口腔黏膜、乳头皮肤及蹄冠部皮肤出现水泡及糜烂为主要特征，幼畜出现出血性胃肠炎和心肌炎。世界动物卫生组织(OIE)将口蹄疫列为法定报告疫病，我国将其列为一类动物疫病。猪A型塞内卡病毒(SenecavirusA,缩写SVA)与FMDV、猪水泡病病毒(缩写SVDV)同属小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)。在2007年之前，SVA主要作为溶瘤细胞被研究，用于治疗某些神经内分泌肿瘤，一直被认为是一种非致病性病毒。但是，之后的研究显示，猪鼻镜出现水泡，蹄部冠状带溃烂等类似水疱病症状，这些样品通过PCR检测确定为SVA阳性。事实表明，SVA并不是非致病性病毒，SVA曾在巴西大规模爆发，导致仔猪死亡，造成严重的经济损失。并且，我国部分地区也相继出现猪场感染SVA的情况，因此有必要研发相应的检测、鉴别试剂或方法。由于SVA是一种新发现的动物传染病，染病猪临床症状主要表现为鼻镜及蹄部冠状带处出现水泡、溃烂创面等水泡性病变，与FMDV造成的口蹄疫极为相似，若未能及时作出准确的鉴别诊断，将会导致防控措施采取不当，进而造成严重的后果。因此，亟需建立能够同时鉴别检测FMDV和SVA的方法或试剂盒，以便于科学合理应对FMDV和SVA的疫病防控。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂、方法及应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂，该试剂包括可以进行双重实时荧光RT-PCR检测FMDV和SVA的FMDV引物探针组和SVA引物探针组；FMDV引物探针组由FMDV特异性引物对和FMDV特异性探针组成，FMDV特异性引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，下游引物为SeqIDNo.2所示序列，FMDV特异性探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列；SVA引物探针组由SVA特异性引物对和SVA特异性探针组成，SVA特异性引物对的上游引物为SeqIDNo.4所示序列，下游引物为SeqIDNo.5所示序列，SVA特异性探针为SeqIDNo.6所示序列或者SeqIDNo.6所示序列的反向互补序列；FMDV特异性探针和SVA特异性探针，两者具有不同的荧光基团，具有相同或不同的荧光淬灭基团。其中，由于两条探针是用于双重实时荧光RT-PCR检测，所以，两条探针具有不同的荧光基团；至于荧光淬灭基团可以相同也可以不同，在此不做具体限定。SeqIDNo.1：5’-CAGGATGATGATTGGCAGAT-3’SeqIDNo.2：5’-ATCTTTGCCAATCAACATCA-3’SeqIDNo.3：5’-TGCACTCAAACAACGGACCGC-3’SeqIDNo.4：5’-CCAACAAGGGTTCCGTCTTC-3’SeqIDNo.5：5’-TTGGACGAATTTGCGTTTTAGA-3’SeqIDNo.6：5’-CTCCGACTTCCTCTCTCTCCGATGCTGT-3’需要说明的是，本申请的试剂特别设计了FMDV和SVA双重实时荧光RT-PCR引物和探针，一方面，FMDV特异性引物对和SVA特异性引物对，两组引物对能够在一个反应体系中进行反应，而不相互干扰，能够各自保持其特异性扩增；另一方面，FMDV特异性探针和SVA特异性探针，两条探针也能够特异性的结合到各自的靶标上，而不会出现特异性结合或者干扰另一条探针的特异性结合。本申请的一种实现方式中，针对FMDV靶标设计了3条特异性上游引物、3条特异性下游引物和2条特异性探针；针对SVA靶标设计了三组特异性引物和探针，并且第三组特异性引物和探针中设计了3条特异性上游引物、3条特异性下游引物和2条特异性探针；对以上引物和探针进行试验筛选，最终筛选出适用于双重实时荧光RT-PCR检测FMDV和SVA的FMDV引物探针组和SVA引物探针组，即SeqIDNo.1所示序列至SeqIDNo.6所示序列的特异性引物和特异性探针。本申请的试剂能够同时特异性的检测FMDV和SVA，并能够有效区分鉴别FMDV和SVA，为口蹄疫或猪A型塞内卡病毒引起的疫病的准确鉴别诊断提供了科学依据，对两者的有效防控具有重要意义。优选的，FMDV特异性探针的5’端具有HEX荧光基团，3’端具有BHQ2荧光淬灭基团。优选的，SVA特异性探针的5’端具有FAM荧光基团，3’端具有BHQ1荧光淬灭基团。本申请的另一方面公开了本申请的试剂在FMDV和/或SVA的检测中的应用。本申请的另一方面公开了本申请的试剂在制备FMDV和/或SVA的检测试剂盒或设备中的应用。本申请的另一方面公开了一种同时检测FMDV和SVA的试剂盒，该试剂盒中包括本申请的试剂。优选的，试剂盒中还包括用于实时荧光RT-PCR的反应液和酶。本申请的再一方面公开了一种同时检测FMDV和SVA的方法，包括采用本申请的试剂，或者本申请的试剂盒，对待测对象的核酸进行双重实时荧光RT-PCR扩增。需要说明的是，本申请的检测方法或试剂盒，都是基于本申请的FMDV和SVA鉴别试剂而构建的，因此，可以用于单独的对FMDV或SVA进行检测鉴别，也可以用于对两者进行同时检测或鉴别，具体根据使用需求而定。此外，本申请的试剂中，虽然FMDV引物探针组和SVA引物探针组可以进行双重实时荧光RT-PCR检测；但是，由于各引物探针组都具有很强的特异性，在不同的使用需求下也可以单独使用。进一步的，FMDV特异性引物对或SVA特异性引物对也同样具有很强的特异性，也可以单独或者组合使用对FMDV和/或SVA进行检测鉴别；可以理解，如果不是进行实时荧光RT-PCR检测，两组引物可以进行双重常规PCR扩增，然后再对扩增产物进行检测即可，而不需要采用特异性探针。相同的，FMDV特异性探针和SVA特异性探针，同样具有很强的特异性，能够单独使用，而不借助于特异性引物对；并且，如果不是进行实时荧光RT-PCR检测，两条探针甚至可以不用设置荧光基团和荧光淬灭基团，两条探针序列可以根据所采用的检测方法，在序列两端进行相应的修饰，在此不做具体限定。本申请的有益效果在于：本申请用于FMDV和SVA鉴别的试剂，其中包括可以进行双重实时荧光RT-PCR检测FMDV和SVA的FMDV引物探针组和SVA引物探针组，能够同时对FMDV和SVA进行检测和区分鉴别，并且，特异性强、灵敏度高，为口蹄疫和猪A型塞内卡病毒的鉴别检测提供了一种高效的技术手段。本申请的试剂，为两种疫病的治疗和预防提供了重要的科学依据，这对于两种疫病的快速防控，减少经济损失，最大限度的保障生产安全具有重大意义。附图说明图1是本申请实施例中用于FMDV和SVA鉴别的试剂对FMDV和SVA的特异性检测结果；图2是本申请实施例中用于F本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂，其特征在于：所述试剂包括可以进行双重实时荧光RT‑PCR检测FMDV和SVA的FMDV引物探针组和SVA引物探针组；所述FMDV引物探针组由FMDV特异性引物对和FMDV特异性探针组成，FMDV特异性引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述FMDV特异性探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；所述SVA引物探针组由SVA特异性引物对和SVA特异性探针组成，SVA特异性引物对的上游引物为Seq ID No.4所示序列，下游引物为Seq ID No.5所示序列，所述SVA特异性探针为Seq ID No.6所示序列或者Seq ID No.6所示序列的反向互补序列；所述FMDV特异性探针和SVA特异性探针，两者具有不同的荧光基团，具有相同或不同的荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂，其特征在于：所述试剂包括可以进行双重实时荧光RT-PCR检测FMDV和SVA的FMDV引物探针组和SVA引物探针组；所述FMDV引物探针组由FMDV特异性引物对和FMDV特异性探针组成，FMDV特异性引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，下游引物为SeqIDNo.2所示序列，所述FMDV特异性探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列；所述SVA引物探针组由SVA特异性引物对和SVA特异性探针组成，SVA特异性引物对的上游引物为SeqIDNo.4所示序列，下游引物为SeqIDNo.5所示序列，所述SVA特异性探针为SeqIDNo.6所示序列或者SeqIDNo.6所示序列的反向互补序列；所述FMDV特异性探针和SVA特异性探针，两者具有不同的荧光基团，具有相同或不同的荧光淬灭基团。2.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：花群义，林彦星，花群俊，曹琛福，杨俊兴，黄超华，曾少灵，阮周曦，张彩虹，林庆燕，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44