【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及一组检测侵袭性真菌的引物和探针、试剂及其应用、试剂盒和检测方法。
技术介绍
1、真菌属于真核生物，广泛存在于自然界中，绝大部分真菌对人类是有利的，少数感染人类则会导致严重的疾病。侵袭性真菌病(invasive fungal disease，ifd)系指真菌侵入人体，在组织、器官或血液中生长、繁殖，并导致炎症反应及组织损伤的感染性疾病。近年来ifd的发病率和死亡率逐年升高，主要因其早期临床表现不典型、早期诊断困难，极易误诊或漏诊。肺部常见的真菌感染有曲霉菌、新生隐球菌、毛霉菌、耶氏肺孢子菌、马尔尼菲篮状菌等。
2、由于真菌感染临床表现不特异、检测技术有限以及早期发现难、治疗药物选择难、预后差等一系列问题，常出现漏诊、误诊，早期诊断、合理用药、抢先治疗是治疗疾病和抢救生命的关键。因此实现早期快速多目标诊断有利于指导合理用药，提高患者生存率具有很大的意义。
3、目前国内临床进行病原体检测方法大多数为镜检、培养、组织病理学、血清学检查，这几种方法阳性率低、假阴性无法排除、不能实现种水平的区分。2019年指南关于ifd确诊标准中首次纳入组织核酸检测的证据。在组织病理学中看到真菌成分时，可以通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)技术结合dna测序来扩增真菌dna。例如，中国专利申请号为202311005500.x的专利技术专利公开了使用多重pcr方法检测荚膜组织胞浆菌、曲霉、毛霉菌及赛多孢菌。再如，中国专利申请号为202311047089.2的专
4、然而，常用的pcr检测中曲霉属的检测方案均与青霉菌有大于95％的序列相似性，因此利用常规序列设计的荧光pcr技术无法区分青霉菌，存在假阳性的风险。毛霉目中的多个毛霉属均致病，利用常规的技术无法全部覆盖，存在假阴性的风险。
5、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供检测侵袭性真菌的引物和探针，能够用于真菌通用、曲霉菌属、毛霉目、新生隐球菌、耶氏肺孢子菌和马尔尼菲篮状菌的检测，以解决上述问题。
2、本专利技术的第二目的在于提供一种检测侵袭性真菌的试剂。
3、本专利技术的第三目的在于提供上述引物和探针或者剂在制备检测侵袭性真菌的产品中的应用。
4、本专利技术的第四目的在于提供一种检测侵袭性真菌的试剂盒。
5、本专利技术的第五目的在于提供一种非疾病诊断和治疗目的的侵袭性真菌的检测方法，包括：采用所述的试剂盒对样品进行扩增。
6、为了实现以上目的，特采用以下技术方案：
7、第一方面，本专利技术提供了检测侵袭性真菌的引物和探针，所述引物的核酸序列如seq id no.1-2、4-5、7-11、14-15、17-18和20-21所示；
8、所述探针的核酸序列如seq id no.3、6、12-13、16、19和22所示。
9、作为进一步技术方案，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭基团；
10、所述荧光报告基团包括fam、vic、rox和cy5；
11、所述淬灭基团包括mgb、bhq1、bhq2和bhq3。
12、作为进一步技术方案，核酸序列如seq id no.3、12、16所示的探针的荧光报告基团互不相同；
13、核酸序列如seq id no.3、13和16所示的探针的荧光报告基团互不相同；
14、核酸序列如seq id no.6、19和22所示的探针的荧光报告基团互不相同。
15、作为进一步技术方案，所述侵袭性真菌包括曲霉菌属、毛霉目、新生隐球菌、耶氏肺孢子菌和马尔尼菲篮状菌中的至少一种。
16、第二方面，本专利技术提供了一种检测侵袭性真菌的试剂，包括所述的引物和探针。
17、第三方面，本专利技术提供了上述引物和探针或者剂在制备检测侵袭性真菌的产品中的应用。
18、第四方面，本专利技术提供了一种检测侵袭性真菌的试剂盒，包括上述引物和探针或者试剂。
19、作为进一步技术方案，所述试剂盒包括a反应管和b反应管；
20、所述a反应管包括核酸序列如seq id no.1-2、7-11和14-15所示的引物，以及核酸序列如seq id no.3、12-13、16所示的探针；
21、所述b反应管包括核酸序列如seq id no.4-5、17-18和20-21所示的引物，以及核酸序列如seq id no.6、19和22所示的探针；
22、优选地，所述a反应管和b反应管还包括内标引物和内标探针；所述内标引物的核酸序列如seq id no.23和24所示；所述内标探针的核酸序列如seq id no.25所示。
23、作为进一步技术方案，还包括扩增反应液。
24、第五方面，本专利技术提供了一种非疾病诊断和治疗目的的侵袭性真菌的检测方法，包括：采用所述的试剂盒对样品进行扩增。
25、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
26、本专利技术提供的检测侵袭性真菌的引物和探针，特异性强、灵敏度高，能够用于真菌通用、曲霉菌属、毛霉目、新生隐球菌、耶氏肺孢子菌和马尔尼菲篮状菌的检测及鉴定。
27、本专利技术提供的检测侵袭性真菌的试剂盒，能够实现病原培养、形态学、免疫学检测所无法完成的快速、全面、敏感和特异性检测，达到如下的检测效果：
28、(一)较高的多重检测能力：检测一份样本，能够实现真菌通用(fungi)、曲霉菌属(asp)、毛霉目(muc)、新生隐球菌(cn)、耶氏肺孢子菌(pj)、马尔尼菲篮状菌(tm)六种病原的一次性多重检测。
29、(二)覆盖度优：能够覆盖常见的以引起呼吸道感染的真菌曲霉菌属、毛霉目、新生隐球菌、耶氏肺孢子菌及马尔尼菲篮状菌。其中曲霉菌属涵盖烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、米曲霉、构巢曲霉、焦曲霉和杂色曲霉；毛霉目涵盖mucor spp(毛霉属)、rhizomucorspp(根毛霉属)、rhizopus spp(根霉属)和lichtheimia(横梗霉属)。
30、(三)特异性优：除了能够与常见的呼吸道感染病原有效区分外，与序列相似度较高的青霉菌也能够有效区分，实现精准检测。
31、(四)最低检出限：150copies/ml，能够实现对低浓度样本的有效扩增。
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1.检测侵袭性真菌的引物和探针，其特征在于，所述引物的核酸序列如SEQ ID NO.1-2、4-5、7-11、14-15、17-18和20-21所示；
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭基团；
3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，核酸序列如SEQ ID NO.3、12、16所示的探针的荧光报告基团互不相同；
4.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述侵袭性真菌包括曲霉菌属、毛霉目、新生隐球菌、耶氏肺孢子菌和马尔尼菲篮状菌中的至少一种。
5.一种检测侵袭性真菌的试剂，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的引物和探针。
6.权利要求1-4任一项所述的引物和探针或者权利要求5所述的试剂在制备检测侵袭性真菌的产品中的应用。
7.一种检测侵袭性真菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的引物和探针或者权利要求5所述的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括A反应管和B反应管；p>
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括扩增反应液。
10.一种非疾病诊断和治疗目的的侵袭性真菌的检测方法，其特征在于，包括：采用权利要求7-9任一项所述的试剂盒对样品进行扩增。
...【技术特征摘要】
1.检测侵袭性真菌的引物和探针，其特征在于，所述引物的核酸序列如seq id no.1-2、4-5、7-11、14-15、17-18和20-21所示；
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭基团；
3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，核酸序列如seq id no.3、12、16所示的探针的荧光报告基团互不相同；
4.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述侵袭性真菌包括曲霉菌属、毛霉目、新生隐球菌、耶氏肺孢子菌和马尔尼菲篮状菌中的至少一种。
5.一种检测侵袭性真菌的试...
【专利技术属性】
技术研发人员：林笑冬，冯晓敏，张瑞，王晓艳，王雷，张志强，
申请(专利权)人：北京卓诚惠生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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