CHO表达系统技术方案

本发明专利技术属于工业蛋白质生产领域，涉及CHO表达系统。发明专利技术人设计并构建了包含编码人或家犬来源的谷氨酰胺合成酶的表达载体的新表达系统，以及CHO细胞系。更具体而言，本发明专利技术涉及以下各项的组合：(i)适用于产生重组蛋白的DNA载体，其中所述载体包含编码谷氨酰胺合成酶的序列，和(ii)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其中所述GS包含与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的序列。

CHO expression system

The invention belongs to the field of industrial protein production, and relates to the CHO expression system. The inventor has designed and constructed a new expression system for the expression vector of glutamine synthetase, which contains the source of the human or the canine, as well as the CHO cell line. More specifically, the invention relates to a combination of the following: (I) for the DNA vector of recombinant protein, wherein the carrier comprises encoding glutamine synthetase sequences, and (II) Chinese hamster ovary (CHO) cell lines, wherein the GS contains sequence and SEQ NO:1 or ID sequence SEQ ID NO:2 at least 94.5% of the same sequence.

【技术实现步骤摘要】
CHO表达系统本申请是申请日为2013年6月14日、中国申请号为201380042643.6、专利技术名称为“CHO表达系统”的专利技术申请的分案申请。专利
本专利技术属于工业蛋白质生产领域。专利技术人设计并构建了包含编码人或家犬来源的谷氨酰胺合成酶的表达载体的新表达系统，以及CHO细胞系。更具体而言，本专利技术涉及以下各项的组合：(i)适用于产生重组蛋白的DNA载体，其中所述载体包含编码谷氨酰胺合成酶的序列，和(ii)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其中所述GS包含与SEQIDNO:1的序列或与SEQIDNO:2的序列至少94.5％相同的序列。
技术介绍
当以工业规模产生重组蛋白时，必需分离产生大量重组蛋白的克隆。将异源基因引入动物宿主细胞并筛选加入的基因的表达是漫长且复杂的过程。该过程涉及转染和选择具有稳定的长期表达的克隆，和筛选重组蛋白的高表达率。在从表达载体产生表达重组蛋白的克隆时，通常将宿主细胞用在同一载体上编码感兴趣的蛋白质和选择标记二者的DNA载体转染。这样的表达载体因而包含选择标记，其允许选择其中存在所述表达载体的克隆。这样的选择标记也可能导致共扩增的发生，由此允许高生产克隆的分离。本领域已知数种这样的选择标记，包括例如G418、潮霉素、嘌呤霉素、新霉素、二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)。特别是GS在工业重组蛋白生产领域广泛用作真核细胞中的选择标记。更具体而言，WO87/04462描述了谷氨酰胺合成酶(GS)作为选择标记的使用。实施例教导了一种表达载体，其包含作为选择标记的编码中国仓鼠来源的GS的序列。进一步显示了这样的表达载体允许在所述表达载体转染至CHO细胞中时产生重组蛋白，所述重组蛋白是tPA。尽管早在八十年代就描述了上述基于使用GS作为选择标记的CHO表达系统，时至今日其仍然是本领域的标准。特别是对于所述原始GS选择标记尚没有显著改进发表。实际上，韩国专利KR10-0267720公开了使用人GS作为选择标记。然而，使用的人GS的精确序列没有公开。另外，其还表明技术效果(高产率)仅与人GS和使用的特定SV40启动子二者相关联(即缺乏128-270位的SV40启动子)。因此本领域需要另外的和/或改进的表达系统，其允许分离大量表达期望产生的重组蛋白的克隆，这些克隆中的至少一些展现出所述重组蛋白的高表达率。
技术实现思路
专利技术人惊讶地发现当在CHO细胞中产生重组蛋白时，使用人或家犬来源的GS比使用CHO来源的GS产生了更好的结果(参见例如图2和3)。特别是发现了使用人来源的GS尤其有利，因为其允许分离比在使用CHO来源的GS时更多的表达所述重组蛋白的克隆，它们中的一些以比使用CHO来源的GS时更高的水平表达所述重组蛋白(参见例如图3)。本专利技术的一个实施方案提供中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其包含脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且其中所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒，其中所述GS包含与SEQIDNO:1的序列或与SEQIDNO:2的序列至少94.5％相同的蛋白质序列；或SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的至少100个连续氨基酸的蛋白质片段。在本专利技术的另一个实施方案中，所述GS包含与SEQIDNO:1的序列或与SEQIDNO:2的序列至少94.5％相同的序列。在本专利技术的另一个实施方案中，所述GS包含与SEQIDNO:1的序列至少97.5％相同的序列。在本专利技术的特定实施方案中，所述GS是人GS并且包含SEQIDNO:1的序列。在本专利技术的另一个实施方案中，所述GS是家犬GS并且具有SEQIDNO:2的序列。在本专利技术的又另一个实施方案中，所述CHO细胞系包含脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒，其中已使所述编码GS的序列的三联密码子偏向于在CHO细胞中的表达。在本专利技术的另一个实施方案中，所述编码GS的序列包含与SEQIDNO:8或SEQIDNO:9的序列至少80％相同的序列。在本专利技术的特定实施方案中，所述编码GS的序列包含SEQIDNO:8或SEQIDNO:9的序列。在本专利技术的另一个实施方案中，将所述编码人GS的序列置于猿猴空泡病毒40(SV40)启动子的调控之下，并且所述重组蛋白是单克隆抗体。在本专利技术的又另一个实施方案中，所述CHO细胞系包含脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒，其中已使所述编码GS的序列的三联密码子偏向于在CHO细胞中的表达。在另一实施方案中，所述载体包含适用于克隆抗体轻链的第一表达盒和适用于克隆抗体重链的第二表达盒。在又另一个实施方案中，所述第一和第二表达盒各自包含CMV启动子，并且所述CHO细胞系能够在不含血清的培养基或不含血清且不含动物来源蛋白质的培养基中生长。在本专利技术的一个实施方案中，所述CHO细胞系是以保藏号CCL-61保藏在ATCC的细胞系或源自以保藏号CCL-61保藏在ATCC的细胞系。在本专利技术的另一个实施方案中，所述CHO细胞系在将所述载体转染至所述以保藏号CCL-61保藏在ATCC的CHO细胞系中时，允许获得产生至少1mg/L重组蛋白的克隆。在本专利技术的又另一个实施方案中，所述CHO细胞系包含脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且所述载体包含谷氨酰胺合成酶(GS)核苷酸序列(即编码谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列)和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒。在一个实施方案中，所述载体不含用于表达重组蛋白的异源基因。在本专利技术的另一个实施方案中，所述载体含有至少一个编码重组蛋白的序列。在另一个实施方案中，所述载体含有编码重组蛋白的异源基因，所述重组蛋白是单克隆抗体。在本专利技术的另一个实施方案中，所述载体含有编码重组蛋白的异源基因，所述重组蛋白是用于诱导抗体应答的免疫原性蛋白质。在本专利技术的另一个实施方案中所述载体含有编码重组蛋白的异源基因，所述重组蛋白是用于酶替代疗法或用于工业用途的酶。本专利技术的一个实施方案提供脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且所述载体包含在猿猴空泡病毒40(SV40)启动子调控下的编码谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和在CMV启动子调控下的适用于克隆异源重组蛋白的第一表达盒。在本专利技术的特定实施方案中，所述GS包含与SEQIDNO:1的序列或与SEQIDNO:2的序列至少94.5％相同的蛋白质序列；或SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的至少100个连续氨基酸的片段。本专利技术的另一个实施方案提供脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且所述载体包含在猿猴空泡病毒40(SV40)启动子调控下的编码谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和在CMV启动子调控下的适用于克隆抗体轻链的第一表达盒和在CMV启动子调控下的适用于克隆抗体重链的第二表达盒。在本专利技术的特定实施方案中，所述GS包含与SEQIDNO:1的序列或与SEQIDNO:2的序列至少94.5％相同的蛋白质序列或SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的至少100个连续氨基酸的片段。本专利技术的一个实施方案提供如图1中所限本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其包含脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且其中所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和至少一种用于表达重组蛋白的表达盒，其中所述GS包含如下序列：‑与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的序列；或‑由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少100个连续氨基酸的片段组成的序列。

【技术特征摘要】
2012.06.14 EP 12305677.21.一种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其包含脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且其中所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和至少一种用于表达重组蛋白的表达盒，其中所述GS包含如下序列：-与SEQIDNO:1的序列或与SEQIDNO:2的序列至少94.5％相同的序列；或-由SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的至少100个连续氨基酸的片段组成的序列。2.根据权利要求1所述的CHO细胞系，其中所述GS包含与SEQIDNO:1的序列并且与SEQIDNO:2的序列至少94.5％相同的序列。3.根据权利要求1或2所述的CHO细胞系，其中所述GS包含与SEQIDNO:1的序列至少97.5％相同的序列。4.根据权利要求1-3中任一项所述的CHO细胞系，其中所述GS是人GS。5.根据权利要求4所述的CHO细胞系，其中所述GS包含SEQIDNO:1的序列。6.根据权利要求1或2所述的CHO细胞系，其中所述GS是家犬GS。7.根据权利要求6所述的CHO细胞系，其中所述家犬GS包含SEQIDNO:2的序列。8.根据权利要求1-7中任一项所述的CHO细胞系，其中已使所述编码GS的序列的三联密码子偏向于在CHO细胞中的表达。9.根据权利要求1-8中任一项所述的CHO细胞系，其中所述编码GS的序列包含与SEQIDNO:8或SEQIDNO:9的序列至少80％相同的序列。10.根据权利要求9所述的CHO细胞系，其中所述编码GS的序列包含SEQIDNO:8或SEQIDNO:9的序列。11.根据权利要求1-10中任一项所述的CHO细胞系，其中将所述编码人GS的序列置于猿猴空泡病毒40(SV40)启动子的调控之下。12.根据权利要求1-11中任一项所述的CHO细胞系，其中所述重组蛋白是单克隆抗体。13.根据权利要求12所述的CHO细胞系，其中所述载体包含适用于克隆抗体轻链的第一表达盒和适用于克隆抗体重链的第二表达盒。14.根据权利要求13所述的CHO细胞系，其中所述第一和第二表达盒各自包含CMV启动子。15.根据权利要求1-14中任一项所述的CHO细胞系，其中所述CHO细胞系能够在不含血清的培养基中生长。16.根据权利要求1-15中任一项所述的CHO细胞系，其中所述CHO细胞系是以保藏号CCL-61保藏在ATCC的细胞系。17.根据权利要求1-16中任一项所述的CHO细胞系，其特征在于在将所述载体转染至所述以保藏号CCL-61保藏在ATCC的CHO细胞系中时，其允许...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·德沃德，B·杜马斯，N·劳尼斯，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：法国,FR