一种DNA甲基转移酶缺陷型CHO细胞系及其制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种DNA甲基转移酶缺陷型CHO细胞系及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除CHO细胞DNA甲基转移酶Dnmt3a基因，筛选并鉴定获得DNA甲基转移酶Dnmt3a缺陷型CHO细胞，通过转染真核表达载体并筛选稳定表达重组CHO细胞株而建立基于DNA甲基转移酶缺陷型的新型CHO细胞表达系统。本发明专利技术通过宿主CHO细胞遗传改造建立重组基因CHO细胞表达系统，能够明显提高重组蛋白的表达水平、同时克服重组蛋白表达不稳定的问题，提高重组蛋白表达稳定性。

A DNA methyltransferase deficient CHO cell line and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种DNA甲基转移酶缺陷型CHO细胞系及其制备方法及应用
本专利技术涉及一种DNA甲基转移酶缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的制备方法及应用，属于基因工程

技术介绍
二十世纪八十年代组织纤溶酶原激活剂(tissuetypeplasminogenactivator,t-PA)在重组中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)细胞中首次成功表达并获得美国FDA批准用于临床，标志着以CHO细胞为基础的生物制药时代的到来。目前CHO细胞源生产的重组药物蛋白已占哺乳动物细胞生产的近70％。但现阶段CHO细胞表达系统存在表达量低、尤其是表达不稳定等问题，无法满足用于疫苗开发、临床治疗和基因疗法等方面日益增长的需求。因此，利用基因和细胞工程的方法进行CHO细胞重组表达研究，对于提高其转基因表达水平和表达稳定性、建立高产稳产的重组蛋白CHO细胞表达系统具有十分重要的意义。研究已证实，通过减少启动子中的CpG岛(CpGislands)而使转基因对甲基化不敏感有利于重组蛋白的高效和持续表达。例如，hCMV-MIE启动子转录起始位点上游的C-179突变为G能够显著提高稳定转染本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA甲基转移酶Dnmt3a基因缺陷型的CHO细胞系。

【技术特征摘要】
1.一种DNA甲基转移酶Dnmt3a基因缺陷型的CHO细胞系。2.根据权利要求1所述的CHO细胞系，其特征在于，所述DNA甲基转移酶Dnmt3a基因组DNA序列为GenBank：NW_003613640.1，Dnmt3a缺陷型CHO细胞基因组DNA序列敲除缺失199个碱基即第41138-41336位碱基；和/或，优选地，所述CHO细胞系选自CHO-K1、CHO-S、CHO-DG44中的任意一种。3.权利要求1或2所述CHO细胞系的制备方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除CHO细胞DNA甲基转移酶Dnmt3a基因而获得。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)针对候选基因确定打靶位点：根据NCBI的GenBank中中国仓鼠DNA甲基转移酶基因Dnmt3a基因组序列No.NW_003613640.1和mRNA序列No.XM_016964036.1设计引物进行相应基因组DNA基因片段PCR扩增，将PCR扩增基因片段进行克隆测序验证序列的准确性；应用在线工具辅助设计Dnmt3a基因的嵌合单链向导RNA打靶位点，根据靶向序列分别设计两对引物以构建表达CRISPR/Cas9的打靶sgRNA载体；2)sgRNA载体的构建：使用BbsI限制性内切酶线性化px330载体质粒并胶回收线性片段；sgRNA寡核苷酸单链退火形成双链；将线性化px330载体与双链sgRNA进行连接过夜；连接产物转化DH5α感受态细胞，氨苄抗性涂板筛选，挑取单菌落，37℃摇床摇菌过夜提取质粒并进行测序验证；选取测序正确的阳性克隆质粒进行细胞转染；3)CHO细胞转染、单克隆挑选及细胞敲除鉴定；优选地，转染前将2.0×105个CHO细胞接种于24孔培养板中，当细胞融合度达到80％-90％时加入上述含有sgRNA的重组质粒共转染CHO细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾岩龙，郭潇，王天云，安文琪，马超援，路江涛，邱乐乐，
申请(专利权)人：新乡医学院，华兰生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41