一种覆盖基因编辑间质干细胞的人工血管制备方法技术

本发明专利技术属于医学技术领域，公开了一种覆盖基因编辑间质干细胞的人工血管制备方法，方法包括：构建过表达GREM1基因的载体；获得GREM1过表达的间质干细胞；将GREM1过表达的间质干细胞悬液和人工血管共同放入脉动生物反应器中培养。本发明专利技术提供的覆盖基因编辑间质干细胞的人工血管，过表达的GREM1基因可以促进间质干细胞存活，覆盖的间质干细胞及其分泌的因子可以抑制移植后炎症，促进血管新生，改善修复下肢缺血的效果，为缺血性疾病的治疗提供新的途径。

An artificial blood vessel preparation method covering gene edited mesenchymal stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种覆盖基因编辑间质干细胞的人工血管制备方法
本专利技术涉及一种覆盖基因编辑间质干细胞的人工血管制备方法，属于医学

技术介绍
外周动脉疾病(PAD)估计全球人口负担为2.02亿人。那些患有严重肢体缺血(CLI)的患者，有缺血性休息疼痛、溃疡和坏疽的晚期，都有增加心血管事件和不良肢体事件的风险，包括手术或截肢。人工血管是许多严重狭窄或闭塞性血管的替代品，多是以尼龙、涤纶(Dacron)、聚四氟乙稀(PTFE)等合成材料人工制造。人工血管的基底层是由多孔的纤维壁构成，多孔结构可以使人工血管对血液保持足够的密封性避免在手术过程中失血过多，同时允许纤维细胞和平滑肌细胞浸入生长，使得受体组织包裹愈合血管假体。但是人工血管移植后会诱发局部炎症反应，甚至导致移植失败。因此，如何降低局部炎症反应，是人工血管移植亟待解决的问题。间质干细胞(MSCs)是一种临床广泛应用的干细胞，具有极强的自我更新及多向分化潜能，并且容易扩增、免疫原性低。MSCs可以替代损伤的血管内皮细胞，通过旁分泌作用促进血管生长、抑制局部炎症、改善局部缺血。尽管MSCs具有较低的免疫原性，使得它们可以广泛应用于细胞移植，但它们用于治疗血管生成的一个主要障碍是由于缺血或炎症环境的影响，在缺血组织中移植的干细胞的存活率很低。MSCs的基因操作可能通过改善移植的MSCs的功能和存活，从而在一定程度上克服这些问题，为提高治疗潜力提供了新的更有效的策略。例如，Kim的研究小组报告说，MSCs的移植经过基因修饰过表达VEGF，增强了梗塞区域的毛细血管形成，并最终削弱了大鼠心肌梗死后的左心室重构。在Bcl2-MSCs移植的动物中，梗死灶的毛细血管密度比对照组高15％。过表达Akt的MSCs不仅减少了细胞死亡，而且还增加了旁分泌因子、IGF1、bFGF、HGF和VEGF的释放。Gremlin1(GREM1)属于骨形态形成蛋白(Bonemorphogeneticprotein,BMP)拮抗剂家族成员，是高度保守的糖化和磷酸化的分泌型蛋白，广泛存在于细胞外、内质网和高尔基氏体中。研究显示，GREM1是一种促血管新生因子，能促进内皮细胞的迁移和侵袭，并能使细胞内信号蛋白的酪氨酸磷酸化，并能促进鸡囊胚血管新生。在体和离体动物实验结果均显示，GREM1可通过与VEGFR2结合，促进血管新生，在血管发育、血管性疾病中发挥作用。申请人之前的研究显示，过表达GREM1-MSCs可以增加MSCs存活，减少局部炎症，促进血管新生，从而提高细胞移植治疗下肢缺血的疗效。综上所述，现有技术存在的问题是：现有人工血管移植后局部炎症炎症，影响人工血管治疗效果。目前利用GREM1过表达MSCs细胞改善人工血管还没有相关文献进行报道。
技术实现思路
为解决现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种覆盖基因编辑间质干细胞的人工血管制备方法，使其在结构和功能上更佳，用于各种动静脉直接移植或替换，达到修复再生的目的。本专利技术所述覆盖基因编辑间质干细胞的人工血管制备方法包括：构建过表达GREM1基因的载体；获得GREM1过表达的间质干细胞；将GREM1过表达的间质干细胞悬液和人工血管共同放入脉动生物反应器中培养。进一步，所述构建过表达GREM1基因的载体，具体包括：通过PCR反应扩增带有attB4和attB1R位点的启动子序列attB4-promoter-attB1R(EF1α启动子)，然后在BPClonaseTMIIEnzymeMix作用下与入门载体pDONRTMP4-P1R发生BP位点间的重组反应，生成入门克隆pENTR-5’-EF1α；通过PCR反应扩增带有attB1和attB2位点的目的基因序列attB1-gene-attB2，然后在BPClonaseTMIIEnzymeMix作用下与入门载体pDONRTM221的attP1和attP2位点发生BP位点间的重组反应，生成入门克隆pENTR-GREM1；通过酶切、连接反应将pLenti6/BLOCK-iT-DEST中的attR1和attR2位点替换为attR4和attR2，，抗性基因的启动子SV40替换PGK，抗性基因Blasticidin序列替换为Puromycin序列，得到目的载体pDESTR4-Puromycin-R2和pDESTR4-Blasticidin-R2；在LRClonaseTMIIEnzymeMix的作用下通过位点特异的连接反应将入门克隆和目的载体连接，即得到载体pLV/final-PGK-Puromycin-EF1α-GREM1(EF1α-GREM1)。进一步，获得GREM1过表达的间质干细胞，还包括：利用Lipofectamine2000，将表达载体和包装质粒ViraPowerTMLentiviralPackagingMix各4.5ug共转染入293FT细胞，进行扩增。48-72h后收集含病毒的上层培养液，4℃，3000rpm离心15min，过滤去除细胞碎片。4℃，50,000g高速离心2小时，浓缩上清液，-80℃冰箱中储存备用。取MSC细胞加入上清液。病毒感染5天后，加入Puromycin筛选4-6天，即可得到感染成功的过表达GREM1的MSC。进一步，检测GREM1-MSCs表型，还包括：将GREM1-MSCs从培养瓶中消化下来，待细胞计数后，向流式检测管中加入约106的细胞。用PBS洗涤细胞后加入100μlPBS混悬细胞，并向不同的流式管中加入不同的流式抗体各1μl，包括CD105、CD73、CD90、CD44、CD34、CD45和CD11b，在蜗旋震荡器上混匀后放在4℃冰箱内孵育30分钟。孵育结束后，用PBS洗涤细胞并离心以去除没有结合的流式抗体。最后向流式管中加入300μlPBS流式检测。使用FlowJo软件对数据进行分析。进一步，检测GREM1-MSCs多向分化潜能，还包括：成骨分化：将GREM1-MSCs消化成单个细胞，以2×104个/cm2的密度加入六孔板的孔中培养，待细胞长到60-70％的密度时，吸去细胞上清液，加入2ml/孔的成骨诱导分化培养液做分化诱导，每隔3天换一次新鲜的成骨培养液。诱导分化2周后，孔板中出现细胞聚集成簇的形态，即是细胞成骨诱导后产生的钙结节，此时终止成骨诱导分化。用10％的中性甲醛固定细胞15分钟，再用PBS洗3次后加入茜素红染液染色15分钟，最后向孔中加入1mlPBS，显微镜下观察和拍照。成脂分化：将GREM1-MSCs消化成单个细胞，以2×104个/cm2的密度加入六孔板的孔中培养，待细胞达到完全融合时，吸去细胞上清液，加入2ml/孔的成脂诱导分化培养液做分化诱导，每隔3天换一次新鲜的成脂培养液。诱导分化3周后，在显微镜下可以观察到有圆形透明的脂肪滴形成即可终止细胞分化。用10％的中性甲醛固定细胞30分钟，再用PBS洗3次后加入油红O染液染色30分钟，最后加入1mlPBS，显微镜下观察和拍照。成软骨分化：GREM1-MSCs消化成单个细胞，吸取1ml密度为3×105/ml的细胞悬液到一个新的15ml离心管中，细胞悬液于1100rpm离心5分钟后弃去上清并留下沉淀，向离心管中缓慢加入1ml成软骨诱导分化培养液，不要摇动或吹打细胞团，小心的将离心管盖拧松，以便于气体交换，细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种覆盖基因编辑间质干细胞的人工血管制备方法，其特征在于，所述覆盖基因编辑间质干细胞的人工血管制备方法包括：构建过表达GREM1基因的载体；获得GREM1过表达的间质干细胞；将GREM1过表达的间质干细胞悬液和人工血管共同放入脉动生物反应器中培养。

【技术特征摘要】
1.一种覆盖基因编辑间质干细胞的人工血管制备方法，其特征在于，所述覆盖基因编辑间质干细胞的人工血管制备方法包括：构建过表达GREM1基因的载体；获得GREM1过表达的间质干细胞；将GREM1过表达的间质干细胞悬液和人工血管共同放入脉动生物反应器中培养。2.如权利要求1所述的覆盖基因编辑间质干细胞的人工血管制备方法，其特征在于，构建过表达GREM1基因的载体，具体包括：通过PCR反应扩增带有attB4和attB1R位点的启动子序列attB4-promoter-attB1R，然后在BPClonaseTMIIEnzymeMix作用下与入门载体pDONRTMP4-P1R发生BP位点间的重组反应，生成入门克隆pENTR-5’-EF1α；通过PCR反应扩增带有attB1和attB2位点的目的基因序列attB1-gene-attB2，然后在BPClonaseTMIIEnzymeMix作用下与入门载体pDONRTM221的attP1和attP2位点发生BP位点间的重组反应，生成入门克隆pENTR-GREM1；通过酶切、连接反应将pLenti6/BLOCK-iT-DEST中的attR1和attR2位点替换为attR4和attR2，，抗性基因的启动子SV40替换PGK，抗性基因Blasticidin序列替换为Puromycin序列，得到目的载体pDESTR4-Puromycin-R2和pDESTR4-Blastici...

【专利技术属性】
技术研发人员：向秋玲，
申请(专利权)人：向秋玲，
类型：发明
国别省市：广东,44