一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin‑4的细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin‑4的细胞系及其构建方法，本发明专利技术采用合成的Nectin‑4基因，利用慢病毒载体系统，构建重组质粒pLOV‑eGFP‑Nectin‑4。将该重组质粒与pSPAX2和pMD2.G质粒共转染293T细胞，获得逆转录病毒样颗粒。将含有逆转录病毒样颗粒的细胞培养上清液感染MDBK细胞，利用嘌呤霉素筛选、纯化，获得了稳定表达Nectin‑4蛋白的MDBK细胞，将其命名为MDBK‑Nectin‑4。该细胞系的建立为深入研究PPRV与受体Nectin‑4的相互作用，以及临床快速分离PPRV提供了实验材料。

A stable expression of Peste des petits ruminants virus receptor Nectin 4 cell lines and its construction method

The invention discloses a stable expression of Peste des petits ruminants virus receptor Nectin 4 cell lines and its construction method, the invention adopts the synthesis of Nectin 4 gene, using lentiviral vector system, the recombinant plasmid pLOV eGFP Nectin 4. The recombinant plasmid was co transfected to 293T cells with pSPAX2 and pMD2.G plasmids, and retrovirus like particles were obtained. The supernatant of MDBK cells infected with retrovirus like particles in cell culture, screening, purification by puromycin, obtained the stable expression of Nectin protein 4 MDBK cells, named MDBK Nectin 4. The establishment of the cell line for the research on the interaction of PPRV and Nectin 4 receptor, and clinical PPRV provides rapid separation of experimental materials.

【技术实现步骤摘要】
一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系及其构建方法
本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系及其构建方法。
技术介绍
小反刍兽疫(Pestedespetitsruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminantsvirus,PPRV)引起的一种急性、高度接触性传染病，主要感染绵羊、山羊等小反刍兽。世界动物卫生组织将其规定为必须上报的疫病，我国将其列为一类动物疫病。该病导致动物的急性发病率和死亡率严重时可分别高达100％和90％。近年来PPR呈现扩散的趋势，我国周边的印度、巴基斯坦等国家均暴发过大规模的疫情。2007年7月，我国西藏地区首次发生了PPR疫情，随即被有关部门迅速扑灭，引起了国家的高度重视。在随后的数年里，我国新疆及西藏地区零散发生了数起PPR疫情。2014年3月，我国的内蒙古、辽宁省、湖南省、江西省、江苏省以及安徽省发生了多起疑似PPR疫情，经国家外来动物疫病研究中心确诊为PPR疫情，这为我国PPR防疫工作再次敲响了警钟！由于目前对于该病尚无特效的治疗方法，主要依靠疫苗进行免疫预防。由于该病具有高发病率和死亡率的特点，PPR疫情给养羊业造成了巨大的危害。作为一种重大的跨国动物传染病，严重威胁着我国畜牧业经济的发展。因此，加强对该病的研究工作具有重要的现实意义。2017年，研究人员在中国安徽省的野生动物河麂体内发现了PPRV感染，野生动物携带PPRV不利于该病毒的消灭计划，提示对于该病的防治工作任重而道远。PPRV属于副粘病毒科麻疹病毒属成员，为单股、负链、不分节段的RNA病毒。PPRV仅有1个血清型，分为4个群。病毒基因组从3′端至5′端依次包含6个基因，对应编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白(N、P、M、F、H、L结构蛋白，以及C和V非结构蛋白)。其中H蛋白具有神经氨酸酶活性和血凝素活性，能够引起感染的细胞出现细胞病变(CPE)。在PPRV感染细胞的过程中，H蛋白首先与宿主细胞受体结合，启动病毒对细胞的感染。科研人员新近发现Nectin-4为PPRV感染宿主上皮细胞的受体。Nectin-4又名脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白，属于Ig球蛋白超家族中的Nectin家族。截至目前，H蛋白如何与受体Nectin-4相互作用的分子机制尚不清楚，有待深入研究。为深入研究H蛋白与受体Nectin-4的相互作用，有必要构建稳定表达Nectin-4蛋白的细胞系。Nectin-4蛋白是PPRV新的受体，能够与构成PPRV囊膜表面纤突的H蛋白存在相互作用，为进一步有待深入研究二者的相互作用，有必要构建过表达病毒受体Nectin-4的细胞系。Adombi等曾经利用构建的稳定表达SLAM的猴CV1细胞系从病料样品中快速、敏感地分离出PPRV。因此，构建稳定表达Nectin-4受体细胞系能够为临床快速分离病毒提供重要的材料，具有重要的现实意义。目前，建立细胞系有多种方法，如直接利用脂质体转染将表达质粒转染靶细胞然后进行筛选获得，但直接转染的方法往往效率不高。慢病毒系统由于能够感染分裂细胞及非分裂细胞，外源基因容量较大，目的基因表达时间较长，不易引发宿主免疫反应等诸多优点，逐渐成为稳定表达外源蛋白细胞系构建的热点。慢病毒细胞系中由于带有嘌呤霉素抗性基因，使用嘌呤霉素筛选时，能够正常存活，而正常对照293T细胞则由于不具备嘌呤霉素抗性而发生死亡。从而有利于快速、高效构建稳定表达外源蛋白的细胞系。
技术实现思路
为了弥补以上不足，本专利技术提供了一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系及其构建方法。本专利技术的方案是：一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系，所述细胞系为MDBK-Nectin-4细胞系，所述细胞系整合了小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，所述细胞系能稳定高效表达Nectin-4基因。一种稳定表达所述小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系的构建方法，包括如下步骤：(1)利用基因重组技术将小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因克隆到慢病毒表达系统pLOV-eGFP载体中，得到重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4；(2)将构建好的重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4与包装质粒pSPAX2和外膜质粒pMD2.G通过脂质体共转染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选出阳性重组细胞系；(3)对阳性细胞系进行Westernblot和IFA鉴定，得到稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系。进一步地，所述步骤(1)具体为：先根据小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，设计带有XmaI和XbaI双酶切位点及保护碱基的小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的特异引物，再通过PCR反应从合成的Nectin-4模板中扩增含有特异性酶切位点的小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，然后在慢病毒表达系统pLOV-eGFP载体的XmaI和XbaI多克隆位点插入小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，得到重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4。进一步地，所述特异引物的序列为：上游引物F(SEQIDNO.1)：5’-TCCCCCCGGGATGCCTCTGTCCCTGGGAGCCG-3’上游引物R(SEQIDNO.2)：5’-GCTCTAGAGACCAGATGCCCCCGCCCGTTGAT-3’。进一步地，所述PCR的反应体系为：上下游引物各2μl、模板DNA1μg、rTaqDNA聚合酶(Mix)50μl，加双蒸水补齐至100μl。进一步地，所述步骤(2)具体为：将构建好的重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4先与包装质粒pSPAX2和外膜质粒pMD2.G通过脂质体共转染293T细胞，再通过含嘌呤霉素筛的培养基筛选出阳性细胞系。进一步地，所述步骤(3)中一抗为鼠源Nectin-4多抗血清。进一步地，所述步骤(3)中IFA的二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，Westernblot的二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。进一步地，所述步骤(3)取第5、10、15和20代次的MDBK-Nectin-4细胞进行Westernblot和IFA检测，以鉴定Nectin-4蛋白的表达。将上述代次的MDBK-Nectin-4细胞系反复冻融3次，裂解后进行SDS-PAGE电泳。将蛋白转印至硝酸纤维素膜后，依次与鼠源Nectin-4多抗血清(1:200倍稀释)和HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:2000)反应，利用ECL化学发光试剂盒进行显色。将上述代次的MDBK-Nectin-4细胞系用丙酮和甲醇的混合液固定，然后进行IFA检测。一抗为鼠源Nectin-4多抗血清(1:200倍稀释)，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(1:1000倍稀释)，荧光显微镜下观察结果。有益效果1.本专利技术首先根据绿色荧光蛋白来观察慢病毒颗粒的成功包装。然后再利用嘌呤霉素抗性加压筛选，得到能够稳定表达Nectin-4蛋白的MDBK-Nectin-4细胞系。该细胞系一方面能够稳定传代20代，表现出良好的遗传稳定性。另一方面相对于亲本MDBK细胞而言，在同样剂量的PPRV感染过程中，能够更加快速的表现出C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin‑4的细胞系，其特征在于，所述细胞系为MDBK‑Nectin‑4细胞系，所述细胞系整合了小反刍兽疫病毒受体Nectin‑4基因，所述细胞系能稳定、高效表达Nectin‑4基因。

【技术特征摘要】
1.一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系，其特征在于，所述细胞系为MDBK-Nectin-4细胞系，所述细胞系整合了小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，所述细胞系能稳定、高效表达Nectin-4基因。2.根据权利要求1所述的一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用基因重组技术将小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因克隆到慢病毒表达系统pLOV-eGFP载体中，得到重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4；(2)将构建好的重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4转染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选出阳性细胞系；(3)对阳性细胞系进行IFA和Westernblot鉴定，得到稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系。3.根据权利要求2所述的一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：先根据小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，设计带有XmaI和XbaI双酶切位点及保护碱基的小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的特异性引物，再通过PCR反应扩增含有上述酶切位点的小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，然后在慢病毒表达系统pLOV-eGFP载体的XmaI和XbaI多克隆位点插入小反刍兽疫病毒受体Nectin-4基因，得到重组表达载体pLOV-eGFP-Nectin-4。4.根据权利要求3所述的一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的细胞系的构建方法，其特征在于，所述特异引物的序列为：上游引物F：5’-TCCCCCCGGGATGCCTCTGTCCCTGGGAGCCG-3’下游引物R：5’-GCTCTAGAGACCAGATGCCCCCGCCCGTTGAT-3’。5.根据权利要求3所述的一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nec...

【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，王元红，杨侃侃，殷冬冬，俞赵荣，蒋书东，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34