Vero‑pAPN细胞系及其制备方法技术

本发明专利技术涉及构建一种Vero‑pAPN细胞系，所采用的构建方法为慢病毒介导法。相较于亲本Vero细胞以及瞬转方式构建的表达pAPN的Vero细胞系来说，该细胞能够稳定表达更高水平的APN蛋白，提高PEDV繁殖滴度，成为更适宜于增殖PEDV的宿主细胞。该细胞可用于后续的病毒培养、分离、纯化，并为疫苗的制备提供宿主原料。

Vero pAPN cell line and its preparation method

The present invention relates to building a Vero pAPN cell line, the construction method for the lentivirus mediated transformation method. Compared with parental Vero cells and pAPN cell line expressing Vero, the cell can express higher level APN protein stably, increase the titer of PEDV propagation, and become a more suitable host cell to proliferate PEDV. The cell can be used for subsequent culture, isolation and purification of the virus, and provide the host material for the preparation of the vaccine.

【技术实现步骤摘要】
Vero-pAPN细胞系及其制备方法
本专利技术涉及生物工程
，尤其是涉及构建一种稳定表达猪氨肽酶N（PorcineAminopeptidaseN,pAPN）的Vero-pAPN细胞系及其制备方法。本专利技术采用慢病毒介导的方法构建稳定细胞系Vero-pAPN，该细胞可用于猪流行性腹泻病毒的培养与分离。
技术介绍
猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDvirus,PEDV）引起的一种高传染性疾病，可以感染各种阶段的猪引发急性水样腹泻，特别是哺乳仔猪感染后会造成严重脱水，其致死率可以高达100%。该病自上世纪七十年代初在英国发现后，比利时、荷兰、德国、法国等国家相继报导该病的发生。我国于1976年发现猪流行性腹泻，并在1983年确认猪流行性腹泻病毒PEDV的存在。近年来，该病暴发区域正不断扩张，2013年PEDV首次在美国被鉴定出来，并迅速传播至墨西哥在内的美洲其它地区。猪流行性腹泻已成为全球养猪行业重要的腹泻疾病之一，给养殖行业造成了严重的经济损失。所以对于猪流行性腹泻病的防御迫在眉睫。目前为止，对于由病毒引起的疾病的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株稳定表达pAPN蛋白的Vero‑pAPN细胞系，该细胞可作为猪流行性腹泻病毒PEDV的宿主细胞，进行病毒的培养、分离、纯化，其特征在于：稳定地将氨基肽酶APN插入Vero细胞染色体，使之能够稳定高水平表达APN，通过增加PEDV受体APN含量从而使PEDV病毒侵染能力提高，获得高滴定度的病毒；通过慢病毒介导的方法将pAPN和嘌呤霉素基因转入Vero细胞中，使之能够在含有嘌呤霉素培养基中生存达到筛选目的；用Western blot和免疫显微技术检测证明，与亲本细胞相比，Vero‑pAPN细胞表达的APN蛋白量更多；病毒滴定度测定结果显示，PEDV 在Vero‑pAPN细胞中的滴定度更高，比亲...

【技术特征摘要】
1.一株稳定表达pAPN蛋白的Vero-pAPN细胞系，该细胞可作为猪流行性腹泻病毒PEDV的宿主细胞，进行病毒的培养、分离、纯化，其特征在于：稳定地将氨基肽酶APN插入Vero细胞染色体，使之能够稳定高水平表达APN，通过增加PEDV受体APN含量从而使PEDV病毒侵染能力提高，获得高滴定度的病毒；通过慢病毒介导的方法将pAPN和嘌呤霉素基因转入Vero细胞中，使之能够在含有嘌呤霉素培养基中生存达到筛选目的；用Westernblot和免疫显微技术检测证明，与亲本细胞相比，Vero-pAPN细胞表达的APN蛋白量更多；病毒滴定度测定结果显示，PEDV在Vero-pAPN细胞中的滴定度更高，比亲本细胞更适宜成为PEDV的宿主细胞。2.一种制备权利要求1所述的稳定表达pAPN蛋白的Vero-pAPN细胞系的方法，其利用慢病毒介导的方法将APN基因插入Vero细胞染色体，其特征在于：通过载体构建的方法，将pAPN基因插入含有嘌呤霉素基因的穿梭质粒载体，形成新的穿梭质粒CD513B-pAPN；以共转的方式将穿梭质粒和骨架质粒同时转入HEK293T细胞中进行慢病毒的包装；测定慢病毒滴定度后，以MOI=1的浓度进行慢病毒侵染Vero细胞实验，通过慢病毒吸附侵染的方式将目的基因pAPN导入Vero细胞，而嘌呤霉素基因的存在使成功介导的细胞得以在含有嘌呤霉素培养基中存活，筛选后的细胞通过有限稀释法得到Vero-pAPN单克隆细胞，该细胞用于后续鉴定以确定其稳定过表达pAPN蛋白。3.一种利用慢病毒介导的方法将APN基因插入Vero细胞染色体的方法，其特征在于：通过载体构建的方法，将pAPN基因插入含有嘌呤霉素基因的穿梭质粒载体，形成新的穿梭质粒CD513B-pAPN；以共转的方式将穿梭质粒和骨架质粒同时转入HEK293T细胞中进行慢病毒的包装；测定慢病毒滴定度后，以MOI=1的浓度进行慢病毒侵染Vero细胞实验，通过慢病毒吸附侵染的方式将目的基因pAPN导入Vero细胞，而嘌呤霉素基因的存在使成功介导的细胞得以在含有嘌呤霉素培养基中存活，筛选后的细胞通过有限稀释法得到Vero-pAPN单克隆细胞，该细胞用于后续鉴定以确定其稳定过表达pAPN蛋白。4.根据权利要求2或3所述方法，其慢病毒包装的主要步骤为：1）用含10%FBS的MEM细胞培养液将HEK293T细胞培养至单层；2）每孔加入1.5mL新鲜培养基（含10%FBS的MEM）替换旧培养基，放回培养箱中继续培养；3）准备转染复合物：取出一支灭菌的1.5mL离心管，加入500μLOpti-MEM培养基，依次加入目的质粒1.5μg和三种辅助质粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G各0.5μg，充分混匀后，加入6μLTurbofect转...

【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，戚伟强，尹彦龙，
申请(专利权)人：武汉中拓康明生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42