本发明专利技术公开了一种制备猪源长效干扰素λ3的方法和应用，属于基因工程产品制备领域。包括编码猪源长效干扰素λ3基因的克隆，含猪源干扰素λ3基因和长效元件用不同Linker连接的真核表达载体的构建，用所述含不同Linker的猪源干扰素长效λ3基因的重组真核表达载体转化GS115，PCR扩增筛选阳性克隆子，接种阳性克隆子于含0.02%生物素的BMGY培养基，28℃200 rpm培养48小时后离心，弃去上清后用等体积含0.02%生物素的BMMY培养基重悬，并加入1%28℃200 rpm甲醇诱导培养，每隔24 h加入终浓度1%甲醇，培养96 h后取上清，制备不同连接Linker的蛋白表达。所述制备的猪源长效干扰素λ3具有更长的半衰期，较报道的普通干扰素λ3半衰期（4 h以内）提高10倍以上。
【技术实现步骤摘要】
一种毕赤酵母表达长效猪源干扰素的方法
：本专利技术属于基因工程产品制备领域，具体涉及一种制备猪源长效干扰素-λ3（ABD-IFNλ3）蛋白的方法和应用。
技术介绍
：干扰素（interferon，IFN）是一种广谱抗病毒剂，包括I型干扰素（IFNα、IFNβ）、II型干扰素（IFNγ等）、III型干扰素（IFNλs，包括IFNλ1、IFNλ2、IFNλ3），其并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。目前，国内外学者III型IFN生物学功能和抗病毒作用已经进行了深入的研究[3-5]，结果表明，相比于I型和II型干扰素，III型干扰素IFNλ3可以有效的缓解仔猪腹泻的症状，降低病猪的死亡率。前期研究表明，原核表达III型猪干扰素均为包涵体形式，需要通过包涵体变性、复性的方法来制备IFNλ3，操作复杂且成本较高[4,6]。采用酵母分泌表达的方式可获得可溶的，表达量的IFNλ3蛋白，但是干扰素半衰期短容易降解，目前已有研究的长效元件ABD能有效提高干扰素半衰期，延长干扰素作用时间[2]。由于干扰素表达过程中易发生断裂，因此用不同连接Linker将长效元件ABD与IFNλ3连接，能获得不影响表达量且蛋白断裂明显较少的表达菌株。参考文献：[1]AlbuminFusionofInterleukin-28B:ProductionandCharacterizationofItsBiologicalActivitiesandProteinStability.（PLOSONE，2013）[2]Anti-serumalbumindomainantibodiesinthedevelopmentofhighlypotent,efficaciousandlong-actinginterferon.（ProteinEngineering,Design&Selection，2010）[3]IFN-lambdapreferablyinhibitsPEDVinfectionofporcineintestinalepithelialcellscomparedwithIFN-alpha.（AntiviralResearch，2017）[4]猪Ⅲ型干扰素IFNλ1的克隆、表达和抗病毒活性研究。(华中农业大学硕士学位论文，2017）[5]Shortcommunication:antiviralactivityofporcineIFN-λ3againstporcineepidemicdiarrheavirusinvitro.（VirusGenes，2016）[6]长效干扰素研究进展。(中国生物工程杂志,2010）
技术实现思路
：为解决现有技术中干扰素表达存在的技术问题，本专利技术旨在提供一种毕赤酵母表达长效猪源干扰素的方法。为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术手段：一种在毕赤酵母GS115中表达猪源长效IFNλ3的方法，具体步骤如下：1）以合成的猪λ3干扰素基因及长效元件ABD为模板，分别用引物λ3-GS-F，λ3-R，ABD-F，ABD-GS-R扩增含GSLinker的目的片段；2）利用引物ABD-F和λ3-R通过PCR技术扩增全长含GSLinker的猪源ABD-GS-IFNλ3基因全长，上游引物ABD-F:agagaggctgaagctgaattcaccactatcgacgagtggttgctgaaa（SEQIDNo:3）；下游引物λ3-R:tgtctaaggctacaaactcaatgatgatgatgatgatgaacacacaagtcacca（SEQIDNo:2）；3）将猪源ABD-IFNλ3基因用T5克隆法克隆到酵母pPicZαA载体，获得重组载体pPicZαA-ABD-GS-IFNλ3，并转化毕赤酵母GS115，筛选重组酵母表达菌；4）对3）中阳性克隆子进行诱导表达，筛选干扰素高表达菌株；5）对4）高表达菌株进行诱导表达并纯化，验证不同Linker对长效干扰素表达的影响，进一步制备干扰素样品及活性检测；6）对5）表达样品，在MDBK及VERO细胞水平上评价干扰素活力；7）对5）表达样品采用细胞病变抑制法检测ABD-GS-IFNλ3在猪体内的半衰期；其中λ3-GS-F:ggtggtggaggttccggtggtggaggttccgttccagttccagaagctttgaga（SEQIDNo:1）；λ3-R:tgtctaaggctacaaactcaatgatgatgatgatgatgaacacacaagtcacca（SEQIDNo:2）；ABD-F:agagaggctgaagctgaattcaccactatcgacgagtggttgctgaaa（SEQIDNo:3）；ABD-GS-R:ccggaacctccaccaccagccttcaatatctcgtcct（SEQIDNo:4）。一种重组酵母菌株pichiapastorisGS115/pPICZαA-ABD-GS-IFNλ3的菌株保藏号为：CCTCCNO.M2018195，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2018年4月11日。所述重组酵母菌株能够用于制备ABD-GS-IFNλ3。本专利技术还请求保护ABD-GS-IFNλ3在制备药物中的应用，所述药物用于治疗或预防病毒感染。所述药物为兽药，用于畜禽。优选的，所述药物用于治疗猪流行性腹泻病毒引起的疾病。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1）通过密码子优化实现ABD-IFNλ3的高效可溶表达。2）ABD融合提高IFNλ3在猪体内的半衰期，有望提高IFNλ3的抗PEDV治疗效果。3）通过Linker选择在不影响产量情况下，能减少蛋白断裂。附图说明图1：构建含有ABD-IFNλ3基因的重组克隆载体的流程图。图2：不同连接Linker长效干扰素表达检测为构建含有不同Linker的ABD-IFNλ3的SDS-PAGE蛋白表达电泳图，其中M：蛋白Markers；+：阳性对照；-：阴性对照；1-3：GS连接Linker三个阳性克隆子表达上清；4-6：HL连接Linker三个阳性克隆子表达上清；7-9：RL连接Linker三个阳性克隆子表达上清。图3：不同连接Linker长效干扰素WerternBolt表达检测是不同Linker的ABD-IFNλ3的Western-blot图，其中M：蛋白Markers；+：阳性对照；-：阴性对照；1-3：GS连接Linker三个阳性克隆子表达上清；4-6：HL连接Linker三个阳性克隆子表达上清；7-9：RL连接Linker三个阳性克隆子表达上清。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限此。实施例1猪源IFNλ3的制备方法，依次进行以下步骤：实施例1：构建克隆载体1）以合成的猪λ3干扰素基因为模板，用2×PrimeStart扩增，分别用λ3-GS-F:ggtggtggaggttccggtggtggaggttccgttccagttccagaagctttgaga（SEQIDNo:1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种在毕赤酵母GS115中表达猪源长效 IFNλ3的方法，具体步骤如下： 1）以合成的猪λ3干扰素基因及长效元件ABD为模板，分别用引物λ3‑GS‑F，λ3‑R，ABD‑F，ABD‑GS‑R扩增含GS Linker的目的片段； 2）利用引物 ABD‑F和λ3‑R 通过PCR技术扩增全长含GS Linker的猪源ABD‑GS ‑IFNλ3基因全长，上游引物ABD‑F,下游引物λ3‑R；3）将猪源ABD‑ IFNλ3 基因用T5克隆法克隆到酵母pPicZαA载体，获得重组载体pPicZαA‑ABD‑GS‑IFNλ3，并转化毕赤酵母GS115，筛选重组酵母表达菌；4）对3）中阳性克隆子进行诱导表达，筛选干扰素高表达菌株；5）对4）高表达菌株进行诱导表达并纯化，验证不同Linker对长效干扰素表达的影响，进一步制备干扰素样品及活性检测；6）对5）表达样品，在MDBK及VERO细胞水平上评价干扰素活力；7）对5）表达样品采用细胞病变抑制法检测ABD‑GS‑IFNλ3在猪体内的半衰期。
【技术特征摘要】
1.一种在毕赤酵母GS115中表达猪源长效IFNλ3的方法，具体步骤如下：1）以合成的猪λ3干扰素基因及长效元件ABD为模板，分别用引物λ3-GS-F，λ3-R，ABD-F，ABD-GS-R扩增含GSLinker的目的片段；2）利用引物ABD-F和λ3-R通过PCR技术扩增全长含GSLinker的猪源ABD-GS-IFNλ3基因全长，上游引物ABD-F,下游引物λ3-R；3）将猪源ABD-IFNλ3基因用T5克隆法克隆到酵母pPicZαA载体，获得重组载体pPicZαA-ABD-GS-IFNλ3，并转化毕赤酵母GS115，筛选重组酵母表达菌；4）对3）中阳性克隆子进行诱导表达，筛选干扰素高表达菌株；5）对4）高表达菌株进行诱导表达并纯化，验证不同Linker对长效干扰素表达的影响，进一步制备干扰素样品及活性检测；6）对5）表达样品，在MDBK及VERO细胞水平上评价干扰素活力；7）对5）表达样品采用细胞病变抑制法检测ABD-GS-IFNλ3在猪体内的半衰期。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中λ3-GS-F:ggtggtggaggttccggtggtggag...
【专利技术属性】
技术研发人员：王荣，左文峰，卢英杰，张磊，杜恩岐，
申请(专利权)人：武汉中拓康明生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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