本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及稳定表达猪源TLR8受体基因的NF‑κB双荧光素酶报告细胞系及其构建方法。该细胞系是指转入了pTLR8基因的HEK293‑NF‑κB细胞，所述HEK293‑NF‑κB细胞是引入了NF‑κB虫荧光素酶和内参海肾荧光素酶的HEK293细胞。本发明专利技术提供能够用于研究pTLR8活化激活下游NF‑κB启动子报告基因检测稳定细胞系。本发明专利技术也为RNA‑Seq技术高通量筛选pTLR8静默和活化状态下稳定细胞内差异表达基因提供了生物材料，并为进一步研究TLR8的种属特异性奠定了基础和平台。
A stable expression of porcine TLR8 receptor gene NF kappa B dual luciferase reporter cells and its construction method
【技术实现步骤摘要】
一种稳定表达猪源TLR8受体基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞及其构建方法
本专利技术属于生物
具体涉及稳定表达猪源TLR8(pTLR8)受体基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系及其构建方法。更具体地说，本专利技术提供能够用于研究pTLR8活化激活下游NF-κB启动子报告基因检测稳定细胞系。本专利技术也为RNA-Seq技术高通量筛选pTLR8静默和活化状态下稳定细胞内差异表达基因提供了生物材料，并为进一步研究TLR8的种属特异性奠定了基础和平台。
技术介绍
天然免疫是机体免疫系统抵御病原感染的第一道防线，由细胞内一系列能够识别病原相关模式分子(Pathogenassociatedmoleculepatterns,PAMP)的模式识别受体(Patternrecognitionreceptors,PRR)介导。其中Toll样受体(Toll-likereceptors,TLR)是最早发现的天然免疫受体家族(PRR)。目前，人和鼠分别有10种和12种TLR[1]。所有的TLR分子都属于I型跨膜糖蛋白，从N端到C端分别是胞外区(EctodomainorExtracellulardomain,ECD)，跨膜区(Transmembrane,TM)和胞浆区(Cytoplasmicdomain,CP)。TLR分子的胞外区(ECD)通常由20-26个LRR(Leucinerichrepeats)基序组成[2]。其中，TLR8属于TLR7/8/9亚类家族。此类TLR分子比其他TLR分子(TLR1-6)稍大，因为这类TLR分子胞外区(ECD)具有26个LRR基序(亮氨酸重复序列)，此外还有几个较大的插入序列和一个位于LRR14和LRR15之间的功能未知区域(Z-loop)[2]。TLR8活化后，胞浆内的TIR结构域聚合，招募具有同源结构域的接头分子MyD88，后者吸引并活化蛋白激酶IRAK4和IRAK2，上述蛋白激酶激活下游连接分子TRAF6和其它激酶如IKK、MEKK3等，引起下游转录因子NF-κB和IRF7的活化[3,4]。这两类转录因子分别诱导细胞产生炎症细胞因子如TNF-α，IL-1β，IL-6等和抗病毒细胞因子I型干扰素(IFN)，如IFN-α。TLR8主要在髓系单核细胞、巨噬细胞和传统树突细胞(cDC)中分布表达，而在浆细胞样树突细胞(pDC)和B细胞中仅少量分布表达。鉴于TLR8主要在髓系细胞中分布，而转录因子IRF7主要在浆细胞样树突细胞(pDC)和B细胞中表达，在髓系细胞基本不表达，因此TLR8体内活化主要诱导炎症细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6等的产生[5,6]。小分子配体Imiquimod(R837)结合猪TLR8，刺激TLR8活化并激活一系列细胞信号通路及其末端的转录因子NF-κB(见文献MolImmunol.2008Jun；45(11):3238-43)[7]。NF-κB在激活后发生核转位、可以结合到虫荧光素酶报告基因的启动子区域，激发虫荧光素酶报告基因的表达。虫荧光素酶报告基因的表达量也就是Imiquimod(R837)的刺激指数能够较好反映pTLR8和小分子R837的识别和结合。家畜TLR8的研究内容匮乏，TLR8信号通路除申请人以前发表的研究外没有其它报道，有必要建立研究猪TLR8信号通路的细胞体系。参考文献1.KawaiT,AkiraS.Theroleofpattern-recognitionreceptorsininnateimmunity:updateonToll-likereceptors.Natureimmunology.2010；11(5):373-84.Epub2010/04/21.doi:10.1038/ni.1863.PubMedPMID:20404851.2.OhtoU,TanjiH,ShimizuT.Structureandfunctionoftoll-likereceptor8.Microbesandinfection/InstitutPasteur.2014；16(4):273-82.Epub2014/02/12.doi:10.1016/j.micinf.2014.01.007.PubMedPMID:24513445.3.QianC,CaoX.RegulationofToll-likereceptorsignalingpathwaysininnateimmuneresponses.AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences.2013；1283:67-74.Epub2012/11/21.doi:10.1111/j.1749-6632.2012.06786.x.PubMedPMID:23163321.4.SchwarzH,PosseltG,WurmP,UlbingM,DuschlA,Horejs-HoeckJ.TLR8andNODsignalingsynergisticallyinducetheproductionofIL-1betaandIL-23inmonocyte-derivedDCsandenhancetheexpressionofthefeedbackinhibitorSOCS2.Immunobiology.2013；218(4):533-42.Epub2012/07/17.doi:10.1016/j.imbio.2012.06.007.PubMedPMID:22795647.5.MakelaSM,StrengellM,PietilaTE,OsterlundP,JulkunenI.MultiplesignalingpathwayscontributetosynergisticTLRligand-dependentcytokinegeneexpressioninhumanmonocyte-derivedmacrophagesanddendriticcells.Journalofleukocytebiology.2009；85(4):664-72.Epub2009/01/24.doi:10.1189/jlb.0808503.PubMedPMID:19164128.6.CaoX.Self-regulationandcross-regulationofpattern-recognitionreceptorsignallinginhealthanddisease.NatRevImmunol.2015；16(1):35-50.Epub2015/12/30.doi:10.1038/nri.2015.8.PubMedPMID:26711677.7.ZhuJ,LaiK,BrownileR,BabiukLA,MutwiriGK.PorcineTLR8andTLR7arebothactivatedbyaselectiveTLR7ligand,imiquimod.Molecularimmunology.2008；45(11):3238-43.Epub2008/04/29.doi:10.1016/j.molimm.2008.02.028.PubMedPMID:18439678.
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种稳定表达猪源TLR8受体(pTL本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种稳定表达猪源TLR8受体基因的NF‑κB双荧光素酶报告细胞系，其特征在于，是指转入了猪源TLR8受体基因pTLR8的HEK293‑NF‑κB细胞，所述HEK293‑NF‑κB细胞是引入了NF‑κB虫荧光素酶和内参海肾荧光素酶的HEK293细胞。
【技术特征摘要】
1.一种稳定表达猪源TLR8受体基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系，其特征在于，是指转入了猪源TLR8受体基因pTLR8的HEK293-NF-κB细胞，所述HEK293-NF-κB细胞是引入了NF-κB虫荧光素酶和内参海肾荧光素酶的HEK293细胞。2.一种稳定表达猪源TLR8受体基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)含pTLR8基因的pcDNA3.1(-)真核表达载体的构建以从猪肠系膜淋巴结中提取总RNA反转录获得的cDNA为模板，利用特异性引物扩增pTLR8全长基因编码区，PCR产物纯化后利用NheI和EcoRV酶切，与同样酶切并带C-端HA标签的pcDNA3.1(-)连接后，获得含pTLR8基因的pcDNA3.1(-)真核表达载体；(2)HEK293-NF-κB双荧光素酶稳定报告细胞的构建：培养人胚肾细胞HEK293至融合度70％-80％，利用表达NF-κB虫荧光素FLuc的慢病毒感染HEK293细胞，感染细胞用10μg/ml杀稻瘟菌素筛选获得稳定表达NF-...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱建中，夏芃芃，李双洁，陈南华，敖大，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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