本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及稳定表达牛源TLR8(bTLR8)受体基因的NF‑κB双荧光素酶报告细胞系及其构建方法。该细胞系是指转入了bTLR8基因的HEK293‑NF‑κB细胞，所述HEK293‑NF‑κB细胞是引入了NF‑κB虫荧光素酶和内参海肾荧光素酶的HEK293细胞。本发明专利技术提供能够用于研究bTLR8活化激活下游NF‑κB启动子报告基因检测的稳定细胞系。本发明专利技术也为RNA‑Seq技术高通量筛选bTLR8静默和活化状态下稳定细胞内差异表达基因提供了生物材料，并为进一步研究TLR8的种属特异性奠定了基础和平台。
A stable expression of bovine TLR8 receptor gene NF kappa B dual luciferase reporter cell line and its construction method
【技术实现步骤摘要】
一种稳定表达牛源TLR8受体基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系及其构建方法
本专利技术属于生物
具体涉及稳定表达牛源TLR8(bTLR8)受体基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系及其构建方法。更具体地说，本专利技术提供能够用于研究bTLR8活化激活下游NF-κB启动子报告基因检测的稳定细胞系。本专利技术也为RNA-Seq技术高通量筛选bTLR8静默和活化状态下稳定细胞内差异表达基因提供了生物材料，并为进一步研究TLR8的种属特异性奠定了基础和平台。
技术介绍
Toll样受体(Toll-likereceptors,TLR)是最早发现的天然模式识别受体(Patternrecognitionreceptors,PRR)，人和鼠分别有10种和12种TLR[1]。TLRs分子是I型跨膜糖蛋白受体，均由胞外区(EctodomainorExtracellulardomain,ECD)，跨膜区(Transmembrane,TM)和胞浆区(Cytoplasmicdomain,CP)组成，其中，ECD包含20-26个LRR(Leucinerichrepeats，亮氨酸重复序列)基序。通过TIR结构域聚合，招募具有同源结构域的接头分子MyD88，可以诱导两条途径的信号转导：一是通过NF-κB途径诱导促炎细胞因子的产生，如TNF-α，IL-1β等；二是通过IRF3/IRF7途径诱导I型干扰素(IFN)的产生[2,3]。TLR8的ECD包含26个LRR基序，以及一个位于LRR14和LRR15之间的功能未知区域(Z-loop)，有研究表明，特定TLR的Z-loop序列在物种间高度保守，而在同一物种的不同TLR之间不保守[4]。而由于TLR8主要在髓系细胞中分布，因此，TLR8主要诱导炎症细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6等的产生[5,6]。TLR8与TLR7、TLR9具有高度的序列同源性，因此在配体识别上有一定的重叠[7]。TLR7的配体Imiquimod(R837)能够结合牛TLR8(bTLR8)，刺激bTLR8活化并激活一系列细胞信号通路及其末端的转录因子NF-κB(MolImmunol.2009Feb；46(5):978-90；MolImmunol.2009Feb；46(5):884-92)[5,8]。而NF-κB在激活后发生核转位、可以结合到虫荧光素酶报告基因的启动子区域，激发虫荧光素酶报告基因的表达。虫荧光素酶报告基因的表达量也就是Imiquimod(R837)的刺激指数能够较好反映bTLR8和小分子R837的识别和结合。家畜TLR8的研究内容匮乏，TLR8信号通路除申请人以前发表的研究外没有其它报道，有必要建立研究牛TLR8信号通路的细胞体系。参考文献1.KawaiT,AkiraS.Theroleofpattern-recognitionreceptorsininnateimmunity:updateonToll-likereceptors.Natureimmunology.2010；11(5):373-84.Epub2010/04/21.doi:10.1038/ni.1863.PubMedPMID:20404851.2.QianC,CaoX.RegulationofToll-likereceptorsignalingpathwaysininnateimmuneresponses.AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences.2013；1283:67-74.Epub2012/11/21.doi:10.1111/j.1749-6632.2012.06786.x.PubMedPMID:23163321.3.CaoX.Self-regulationandcross-regulationofpattern-recognitionreceptorsignallinginhealthanddisease.NatRevImmunol.2015；16(1):35-50.Epub2015/12/30.doi:10.1038/nri.2015.8.PubMedPMID:26711677.4.WerlingD,JannOC,OffordV,GlassEJ,CoffeyTJ.Variationmatters:TLRstructureandspecies-specificpathogenrecognition.Trendsinimmunology.2009；30(3):124-30.Epub2009/02/13.doi:10.1016/j.it.2008.12.001.PubMedPMID:19211304.5.ZhuJ,BrownlieR,LiuQ,BabiukLA,PotterA,MutwiriGK.CharacterizationofbovineToll-likereceptor8:ligandspecificity,signalingessentialsitesanddimerization.Molecularimmunology.2009；46(5):978-90.Epub2008/11/11.doi:10.1016/j.molimm.2008.09.024.PubMedPMID:18995910.6.MakelaSM,StrengellM,PietilaTE,OsterlundP,JulkunenI.MultiplesignalingpathwayscontributetosynergisticTLRligand-dependentcytokinegeneexpressioninhumanmonocyte-derivedmacrophagesanddendriticcells.Journalofleukocytebiology.2009；85(4):664-72.Epub2009/01/24.doi:10.1189/jlb.0808503.PubMedPMID:19164128.7.WangJ,ShaoY,BennettTA,ShankarRA,WightmanPD,ReddyLG.ThefunctionaleffectsofphysicalinteractionsamongToll-likereceptors7,8,and9.JBiolChem.2006；281(49):37427-34.Epub2006/10/17.doi:10.1074/jbc.M605311200.PubMedPMID:17040905.8.ZhuJ,LaiK,BrownileR,BabiukLA,MutwiriGK.PorcineTLR8andTLR7arebothactivatedbyaselectiveTLR7ligand,imiquimod.Molecularimmunology.2008；45(11):3238-43.Epub2008/04/29.doi:10.1016/j.molimm.2008.02.028.PubMedPMID:18439678.
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种稳定表达牛源TLR8受体(bTLR8)基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系。本专利技术建立在自主获得的bTLR8基因、克隆的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种稳定表达牛源TLR8受体基因的NF‑κB双荧光素酶报告细胞系，其特征在于，是指转入了牛源TLR8受体基因的HEK293‑NF‑κB细胞，所述HEK293‑NF‑κB细胞是引入了NF‑κB虫荧光素酶和内参海肾荧光素酶的HEK293细胞。
【技术特征摘要】
1.一种稳定表达牛源TLR8受体基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系，其特征在于，是指转入了牛源TLR8受体基因的HEK293-NF-κB细胞，所述HEK293-NF-κB细胞是引入了NF-κB虫荧光素酶和内参海肾荧光素酶的HEK293细胞。2.一种稳定表达牛源TLR8受体基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)HEK293-NF-κB双荧光素酶稳定报告细胞的构建：培养人胚肾细胞HEK293至融合度70％-80％，利用表达NF-κB虫荧光素(FLuc)的慢病毒感染HEK293细胞，感染细胞用杀稻瘟菌素筛选获得稳定表达NF-κB报告基因的HEK293细胞系；两次有限稀释法亚克隆，细胞克隆用TNF-α刺激，筛选对TNF-α刺激诱导产生高水平NF-κB活化、高表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱建中，夏芃芃，李双洁，陈南华，敖大，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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