重组细胞、筛选L型钙通道调节剂的方法、试剂在制备药物中的用途和药物组合物技术

本发明专利技术提出了重组细胞、筛选L型钙通道调节剂的方法、试剂在制备药物中的用途和药物组合物。所述重组细胞表达：第一蛋白，所述第一蛋白含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其功能性变体，并且所述第一蛋白为膜蛋白；第二蛋白，所述第二蛋白含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其功能性变体；以及第三蛋白，所述第三蛋白含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能性变体，其中，所述第二蛋白和第三蛋白的至少之一锚定于细胞膜上。本发明专利技术的重组细胞能够实现第二蛋白和第三蛋白的至少之一转移到细胞膜附近，使得其与第一蛋白在空间位置上足够靠近，从而发挥CMI作用，对α1DS实现专一性抑制，并使抑制效果达到CMI极限水平。

Recombinant cells, methods for screening L type calcium channel regulators, the use of reagents in the preparation of drugs and pharmaceutical compositions

The present invention provides a method for recombinant cells, the screening of L type calcium channel regulator, the use of the reagent in the preparation of the drug and the pharmaceutical composition. The expression of the recombinant protein: the first, the first protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 shown or functional variants, and the first protein is a membrane protein; second proteins, the protein contains second amino acid sequence of SEQ ID NO:2 shown or functional variant thereof; and third protein, the protein containing third amino acid sequence of SEQ ID NO:3 shown or functional variant thereof, wherein, at least one of the second anchor proteins and third proteins on the cell membrane. At least one of the recombinant cells of the invention can realize second proteins and third proteins transferred to nearby cell membrane, making it the first protein close enough position in space, thus playing the role of the CMI, to achieve specific inhibition of 1DS alpha, and to reach the CMI limit level inhibition effect.

【技术实现步骤摘要】
重组细胞、筛选L型钙通道调节剂的方法、试剂在制备药物中的用途和药物组合物
本专利技术涉及生物医药领域。具体地，本专利技术涉及重组细胞、筛选L型钙通道调节剂的方法、试剂在制备药物中的用途和药物组合物。
技术介绍
L型钙通道(L-TypeCalciumChannel，LTCC)是电压门控钙通道(Voltage-GatedCalciumChannel，VGCC)的重要成员，通过介导钙内流并且参与细胞电活动在多种生理活动中发挥关键的作用。在LTCC包含的四种亚型(CaV1.1，CaV1.2，CaV1.3和CaV1.4)中，CaV1.3广泛分布在心血管及神经系统等多种兴奋性组织中。CaV1.3具有独特的电生理特性，相较于其它亚型能够被域下膜电位激活，因而能够参与并调控心脏起搏、激素释放及神经元自发放电等重要生命过程。目前普遍认为表达在黑质致密部(substantianigraparscompacta，SNc)神经元的CaV1.3控制自发性域下钙振荡，与帕金森疾病(Parkinson’sdisease，PD)的发生密切相关。另外，编码CaV1.3的基因CACNA1D产生突变会导致一系列严重的疾病，如原发性醛固酮增多症、自闭症、神经系统异常及癫痫等。CaV1.3的门控特性受到通道自身碳末端(Distalcarboxyltail，DCT)和未结合钙离子的钙调蛋白(Calmodulin，CaM)的竞争调控，最终影响通道的电压门控激活特性(voltage-gatedactivation，VGA)及钙依赖失活特性(Ca2+-dependentinactivation，CDI)。DCT包含两个重要的区域，即远碳端调节结构域(DistalC-terminusRegulatoryDomain，DCRD)和近碳端调节结构域(ProximalC-terminusRegulatoryDomain，PCRD)，携带正电荷的PCRD与携带负电荷的DCRD相互配合能够调节CaM与通道碳端的preIQ3-IQ结构域(简称为IQV结构域)的结合能力，进而影响通道的活动。CaV1.3与其它LTCC亚型不同，可通过选择性剪接产生不同碳端的剪接变体，其中CaV1.342(也称为α1DL)由外显子42编码而得，该通道携带有完整的CTM，CaV1.342a(也称为α1DS)由外显子42a编码而得，该通道在IQ结构域后终止编码，缺失PCRD和DCRD的相应区域，因而CaM更容易与其IQV结构域发生预结合，该通道表现出很强的CDI和较负的激活电压。α1DL和α1DS两种剪接变体在大脑和心脏的多种组织内均有分布，有助于适应不同生理条件对CaV1.3电学活动的需求。对于维持神经元域下钙振荡及自发放电，α1DS的贡献相较于α1DL更为显著，因此如何有效地特异性抑制α1DS的活动能够干预细胞钙失调(如钙超载等)导致的严重病变，不仅有利于维持心脑等器官的生理机能，也有助于治疗心律失常及帕金森等重大疾病。目前可使用基于二氢吡啶类(1,4-dihydropyridines，DHPs)的LTCC传统小分子抑制剂如尼莫地平nimodipine、伊拉地平isradipine等对CaV1.3的活动进行抑制，这些抑制剂能够与LTCC的α1亚基细胞膜外侧的相应受体结合，通过减少功能性通道的数量使通道钙电流(如Ipeak和I300)整体发生变化，从而导致钙内流总量的减少。由此可见，DHPs这一类药物并不影响通道内在的门控特性，阻断过程中通道的CDI强度(用参数SCa表示)保持不变(图1)。由于LTCC自身的DCT与CaM竞争性调节通道的激活或失活性质，因此基于两者的竞争关系理性设计并开发基因编码的抑制多肽以选择性靶向CaV1.3一直得到热切关注，这种方法作为不同于LTCC传统小分子抑制剂的新型抑制方法，不仅能够在生物体内实现局部高表达及高效力而且对生物体各系统的副作用小，为选择性抑制CaV1.3的剪接变体α1DS提供了可能的解决途径，同时对于CaV1.3相关的神经退行性疾病具有治疗干预潜力。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提出了重组细胞、筛选L型钙通道调节剂的方法、试剂在制备药物中的用途和药物组合物。本专利技术的重组细胞能够实现第二蛋白和第三蛋白的至少之一转移到细胞膜附近，使得其与第一蛋白在空间位置上足够靠近，从而发挥CMI作用，对α1DS实现专一性抑制，并使抑制效果达到CMI极限水平。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：文献“基于碳末端的多域协同急性抑制L型钙通道”(CooperativeandacuteinhibitionbymultipleC-terminalmotifsofL-typeCa2+channels)提出了一种抑制L型钙通道的新型方式，即碳末端介导的抑制(C-terminusmediatedinhibition，CMI)。这种新型抑制方式基于L型钙通道碳末端的三个关键结构域(IQV结构域、PCRD和DCRD)之间的协同抑制法则，如图2所示，在其中任何两个结构域空间距离足够接近的情况下，第三个结构域可作为调控多肽使三者形成复合体，最终阻碍CaM与通道结合，进而改变通道门控特性，降低钙内流的总量。根据该法则，图3所示的方法使PCRD和DCRD分别与FRB和FKBP融合，两种融合蛋白与CaV1.3剪接变体α1DS共表达在细胞中，由于小分子化学药物雷帕霉素(rapamycin)能够同时与FRB和FKBP两种蛋白结合，因此，加入雷帕霉素可诱导PCRD和DCRD两个多肽发生连接导致这两者的相对位置足够靠近，迅速抑制了α1DS的CDI程度及钙电流瞬态峰值，但并不影响其稳态电流水平，最终实现钙内流总量的下调。但是，PCRD和DCRD都属于小分子多肽，大约由100个氨基酸构成，与雷帕霉素结合的FRB和FKBP也大约包含100个氨基酸，由此可见这四种多肽具有同一数量级水平的空间结构。当PCRD和DCRD分别与FRB和FKBP融合后，雷帕霉素与FRB和FKBP结合形成的复合体虽然可导致PCRD和DCRD发生连接，但是该复合体的空间结构在一定程度上限制了PCRD和DCRD的极限距离，两者很难实现足够近的相对位置以协同发挥强劲的抑制效力，从图3的实验结果可以看出这种方法确实无法使α1DS达到直接共表达融合蛋白PCRD-DCRD的抑制水平，因此现有的方法不适用于大幅度地改变α1DS的CDI程度和钙电流瞬态峰值。有鉴于此，为了充分利用碳末端三个关键结构域协同组合法则，专利技术人从碳末端三个关键结构域的位置分布出发设计并开发针对CaV1.3剪接体α1DS的新型抑制方法及抑制多肽。由于功能性的α1DS的IQV结构域主要分布在细胞膜附近，因此将PCRD或DCRD转移到细胞膜附近就能有效拉近PCRD与IQV结构域或DCRD与IQV结构域的空间距离，进而实现CMI对CaV1.3剪接变体α1DS的抑制。基于上述设计思路，为了进行初步验证，首先专利技术人通过融合Ras蛋白的膜锚定序列将PCRD或DCRD稳定定位在细胞膜附近，将PCRD-CFP-Ras和DCRD-CFP-Ras分别与α1DS共表达，如图4所示，α1DS的CDI程度均未发生明显改变，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达：第一蛋白，所述第一蛋白含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其功能性变体，并且所述第一蛋白为膜蛋白；第二蛋白，所述第二蛋白含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其功能性变体；以及第三蛋白，所述第三蛋白含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能性变体，其中，所述第二蛋白和第三蛋白的至少之一锚定于细胞膜上。

【技术特征摘要】
1.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达：第一蛋白，所述第一蛋白含有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列或其功能性变体，并且所述第一蛋白为膜蛋白；第二蛋白，所述第二蛋白含有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列或其功能性变体；以及第三蛋白，所述第三蛋白含有SEQIDNO：3所示的氨基酸序列或其功能性变体，其中，所述第二蛋白和第三蛋白的至少之一锚定于细胞膜上。2.根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述第二蛋白和所述第三蛋白的至少之一是通过锚定序列锚定在所述细胞膜上，任选地，所述锚定序列含有SEQIDNO：4所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述第二蛋白和所述第三蛋白的至少之一与所述锚定序列呈融合蛋白的形式。3.根据权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述第二蛋白、所述第三蛋白与所述锚定序列分别独立地与荧光蛋白相连，所述荧光蛋白为选自青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的至少之一。4.根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述锚定序列与第一靶序列相连，所述第二蛋白与第三蛋白的至少之一与第二靶序列相连，并且所述重组细胞进一步含有中间连接蛋白，所述中间连接蛋白包括：第一结合序列，所述第一结合序列特异性地与所述第一靶序列结合；第二结合序列，所述第二结合序列特异性地与所述第二靶序列结合，任选地，所述第一靶序列是如SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，所述第二靶序列是如SEQIDNO：6所示的氨基酸序列。5.一种筛选L型钙通道调节剂的方法，其特征在于，包括：将候选试剂与权利要求1～4任一项所述的重组细胞接触；检测所述接触前后所述重组细胞的钙通道参数，所述钙通道参数的变化是所述候选试剂为所述L型钙离子通道调节剂的指示，所述钙通道参数包括CDI程度和钙电流瞬态峰值的至少之一。任选地，接触后所述钙通道的CDI程度和钙电流瞬态峰值的至少之一降低，是所述候选试剂为所述L型钙离子通道抑制剂的指示。6.试剂在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗神经退行性疾病，所述试剂适于使患...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓冬，刘楠，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11