脊椎动物DNA甲基转移酶的DNA5-甲基胞嘧啶去甲基活性制造技术

本发明专利技术是公开将测试药剂鉴定为DNA甲基转移酶的活化DNA去甲基活性的调节物的方法。该方法包括：a)提供甲基化DNA；b)提供该DNA甲基转移酶；c)在测试药剂存在或不存在下，使该甲基化DNA与该DNA甲基转移酶反应一段足够的时间，以进行去甲基反应并产生去甲基DNA产物；d)分析去甲基反应的程度；以及d)比较在该测试药剂存在与不存在下的去甲基反应的程度，从而由此将该测试药剂鉴定为该DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的调节物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脊椎动物DNA甲基转移酶的DNA5-甲基胞嘧啶去甲基活性
总体而言，本专利技术是关于DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性，及其治疗与诊断的用途。
技术介绍
在脊椎动物中，DNA甲基化主要发生在CpG二分体内的胞嘧啶(cytosine，C)的5-位置，且其基因组甲基化模式是由该DNA(C-5)-甲基转移酶(或称DNMTs)所建立/维持。在已知的脊椎动物DNMTs中，DNMT1显现出对半甲基化DNA的底物偏好，且维持了在DNA复制期间的甲基化模式。在体外，DNMT3A与DNMT3B对未甲基化以及半甲基化的DNA显现出相等的C-5甲基化活性，且其对于起始性基因组DNA甲基化(denovogenomicDNAmethylation)与早期胚胎的发育是不可或缺的。包含上述三种必要的DNMTs的脊椎动物DNA甲基化系统对基因组DNA甲基化模式的全面与局部建立是不可或缺的，因此对基因表达、神经可塑性、分化、致癌、印迹(imprinting)、X染色体去活化及发育的过程也是不可或缺的。在2012年以前的文献中对于脊椎动物中是否存在可以主动且直接地在DNA上将5-mC转换为C的酶仍是未知。
技术实现思路
在一方面，本专利技术涉及一种用于鉴定测试试剂(或化合物)为能够调节DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的调节物的方法。该方法包括：a)提供甲基化DNA；b)提供DNA甲基转移酶；c)在测试药剂存在或不存在下，使该甲基化DNA与该DNA甲基转移酶反应一段足够的时间，以进行去甲基反应并产生去甲基DNA产物；d)分析去甲基反应的程度；以及e)比较在该测试试剂存在与不存在下的去甲基反应的程度，从而由此将该测试药剂鉴定为能够调节该DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的调节物；其中当去甲基反应的程度在该测试药剂存在下较低时，该测试试剂被鉴定为能够抑制该DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的抑制剂；或当去甲基反应的程度在该测试药剂存在下较高时，该测试药剂被鉴定为能够刺激该DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的刺激剂。于本专利技术的一个具体实施例中，该分析步骤是通过选自由限制酶切-聚合酶连锁反应(restrictiondigestion-polymerchainreaction，PCR)分析、水解-薄层色层分析、以抗体为基础的分析、闪烁计数、放射摄影术、斑点印迹(dotblotting)、以液相层析为基础的分析以及以亚硫酸氢钠为基础的分析所组成的群组的技术以进行。于本专利技术的另一个具体实施例中，该去甲基反应在约为10μM至10mM的钙离子存在下进行。于本专利技术的另一个具体实施例中，该DNA甲基转移酶为分离的脊椎动物DNA甲基转移酶或重组的DNA甲基转移酶，或存在于核萃取物中或存在于细胞萃取物中。该脊椎动物DNA甲基转移酶、该核萃取物，或该细胞萃取物由选自于由脊椎动物细胞培养、脊椎动物组织、昆虫细胞、虫细胞、昆虫组织、虫组织、植物细胞、植物组织、酵母菌细胞，以及细菌细胞所组成的群组的细胞制备。其中该核萃取物可为精子萃取物。在本专利技术的另一个具体实施例中，该甲基化DNA包含经标记的甲基基团。所述甲基化DNA内的该甲基基团可为经放射性标记。于本专利技术的另一个具体实施例中，前述方法的步骤(a)至(d)包含下列技术特征：其中，(a)在步骤(a)中所提供的该甲基化DNA为可操作地连接于组成型启动子的甲基化报道基因且存在于细胞内；(b)在步骤(b)中所提供的该DNA甲基转移酶为可操作地连接于组成型启动子且也存在于该细胞内，或内生地存在于该细胞内，作为内生的DNA甲基转移酶；(c)在步骤(c)中所产生的该去甲基DNA产物为去甲基化报道基因，其在该细胞内表达报道蛋白；以及(d)该分析步骤通过选自于由下列所组成的群组的技术以进行：(i)分析在该细胞中由该去甲基化报道基因所编码的报道蛋白的信号；(ii)以蛋白质印迹法(Westernblot)分析该报道蛋白的表达；以及(iii)分离该甲基化与去甲基化报道基因并通过限制酶切-聚合酶连锁反应(PCR)分析、水解-薄层色层分析、以抗体为基础的分析、闪烁计数、放射摄影术、斑点印迹、以液相层析为基础的分析以及以亚硫酸氢钠为基础的分析以分析去甲基反应的程度。于本专利技术的一个具体实施例中，该甲基化报道基因与该DNA甲基转移酶是经由转染作用存在于该细胞内。或可选择地，该DNA甲基转移酶为存在于该细胞内的内生的酶。该甲基化报道基因转染该细胞，且该DNA甲基转移酶可为转染至该相同细胞内的外源的酶或已经存在于该相同细胞内的内生的酶。于一个具体实施例中，该甲基化报道基因与该DNA甲基转移酶共转染至该细胞内。于本专利技术的一个具体实施例中，该测试药剂被导入该细胞内或加入浸泡该细胞的培养基中。于本专利技术的另一个具体实施例中，该甲基化报道基因包含选自于由荧光蛋白编码基因、荧光素酶基因、抗药基因以及细胞存活的基因所组成的群组的基因的DNA序列。于本专利技术的另一个具体实施例中，该甲基化DNA包含5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)的DNA。于本专利技术的另一个具体实施例中，步骤(c)是于无还原剂的环境下或于非还原的环境下进行。该DNA甲基转移酶可为野生型DNA甲基转移酶的修饰形式，所述修饰形式保留该野生型DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性。该DNA甲基转移酶可选自于由DNA甲基转移酶1、DNA甲基转移酶3A、DNA甲基转移酶3B及其任何组合所组成的群组。该组成型启动子可为，但不限于，巨细胞病毒(cytomegalovirus)启动子。于另一方面，本专利技术关于一种将测试药剂鉴定为能够调节DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的调节物的方法，其中该方法包括：(I)a)在测试药剂存在或不存在下，将含有甲基化DNA的第一组合物与含有该DNA甲基转移酶的第二组合物混合；b)经由将该甲基化DNA与该DNA甲基转移酶反应一段足够的时间而使去甲基反应发生，以产生去甲基化DNA产物；c)分析去甲基反应的程度；以及d)比较在该测试药剂存在与不存在下该去甲基反应的程度，从而由此鉴定该用于调节该DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的测试药剂；其中当去甲基反应的程度在该测试药剂存在下较低时，该测试药剂被鉴定为能够抑制该DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的抑制剂；或当去甲基反应的程度在该测试药剂存在下较高时，该测试药剂被鉴定为能够刺激该DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的刺激剂；或者(II)1)提供含有经甲基化且可操作地连接于组成型启动子的报道基因转染的细胞的细胞培养基，该细胞含有内生的DNA甲基转移酶或外源地表达野生型、修饰的或基因工程改造的DNA甲基转移酶；2)将该细胞暴露于测试药剂；3)使去甲基反应发生，以产生去甲基报道基因，其在该细胞内表达报道蛋白；以及4)通过检测在该细胞中该去甲基报道基因表达的该报道蛋白的信号强度，以分析该报道基因的去甲基反应的程度；5)比较在该测试药剂存在与不存在下，该报道基因的去甲基反应的程度，从而由此将该测试药剂鉴定该作为能够调节该DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的调节物；其中当去甲基反应的程度在该测试药剂存在下较低时，该测试药剂被鉴定为能够抑制该DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的抑制剂；或当去甲基反应的程度在该测试药剂存在下较高时，该测试药剂被鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将测试药剂鉴定为DNA甲基转移酶的活化DNA去甲基活性的调节物的方法，包括：a)提供甲基化DNA；b)提供该DNA甲基转移酶；c)在测试药剂存在或不存在下，使该甲基化DNA与该DNA甲基转移酶反应一段足够的时间，以进行去甲基反应并产生去甲基DNA产物；d)分析去甲基反应的程度；以及d)比较在该测试药剂存在及不存在下的去甲基反应的程度，从而将该测试药剂鉴定为该DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的调节物；其中当去甲基反应的程度在该测试药剂存在下较低时，该测试药剂被鉴定为该DNA甲基转移酶的活化DNA去甲基活性的抑制剂；或当去甲基反应的程度在该测试药剂存在下较高时，该测试药剂被鉴定为该DNA甲基转移酶的活化DNA去甲基活性的刺激剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.12.12 US 61/736,1801.一种将测试药剂鉴定为能够调节脊椎动物DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的调节物的方法，包括：a)提供甲基化DNA；b)提供该脊椎动物DNA甲基转移酶；c)在测试药剂存在或不存在下，使该甲基化DNA与该脊椎动物DNA甲基转移酶反应以进行去甲基反应并产生去甲基DNA产物，其中该去甲基反应是在钙离子的存在下进行；d)分析去甲基反应的程度；以及e)比较在该测试药剂存在及不存在下的去甲基反应的程度，从而将该测试药剂鉴定为能够调节该脊椎动物DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的调节物；其中当去甲基反应的程度在该测试药剂存在下较低时，该测试药剂被鉴定为能够抑制该脊椎动物DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的抑制剂；或当去甲基反应的程度在该测试药剂存在下较高时，该测试药剂被鉴定为能够刺激该脊椎动物DNA甲基转移酶的DNA去甲基活性的刺激剂。2.如权利要求1所述的方法，其中该分析步骤是通过选自于由限制酶切-聚合酶连锁反应(PCR)分析、水解-薄层色层分析、以抗体为基础的分析、闪烁计数、放射摄影术、斑点印迹、以液相层析为基础的分析以及以亚硫酸氢钠为基础的分析所组成的群组的技术以进行。3.如权利要求1所述的方法，其中该去甲基反应在10μM至10mM的钙离子存在下进行。4.如权利要求1所述的方法，其中该脊椎动物DNA甲基转移酶是分离的脊椎动物DNA甲基转移酶或重组DNA甲基转移酶，或存在于核萃取物中或存在于细胞萃取物中。5.如权利要求4所述的方法，其中该脊椎动物DNA甲基转移酶、该核萃取物或该细胞萃取物是制备自选自于由脊椎动物细胞培养物、脊椎动物组织、昆虫细胞、虫细胞、昆虫组织、虫组织、植物细胞、植物组织、酵母菌细胞以及细菌细胞所组成的群组的细胞。6.如权利要求4所述的方法，其中该核萃取物是精子萃取物。7.如权利要求1所述的方法，其中该甲基化DNA包含经标记的甲基基团。8.如权利要求7所述的方法，其中该甲基化DNA内的甲基基团经放射性标记。9.如权利要求1所述的方法，其中：(a)在步骤(a)中所提供的该甲基化DNA为可操作地连接于组成型启动子的甲基化报道基因且存在于细胞内；(b)在步骤(b)中所提供的该脊椎动物DNA甲基转移酶为可操作地连接于组成型启动子且也存在于该细胞内；(c)在步骤(c)中所产生的该去甲基DNA产物是去甲基报道基因，其在该细胞内表达报道蛋白；以及(d)该分析步骤是通过选自于由下列所组成的群组的技术以进行：(i)分析在该细胞中由该去甲基报道基因所编码的报道蛋白的信号；(ii)以蛋白质印迹法分析该报道蛋白的表达；以及(iii)分离该甲基化与去甲基报道基因并通过限制酶切-聚合酶连锁反应(PCR)分析、水解-薄层色层分析、以抗体为基础的分析、闪烁计数、放射摄影术、斑点印迹、以液相层析为基础的分析或以亚硫酸氢钠为基础的分析以分析去甲基反应的程度。10.如权利要求9所述的方法，其中该甲基化报道基因与该脊椎动物DNA甲基转移酶是经由转染作用存在于该细胞内。11.如权利要求1所述的方法，其中：(a)在步骤(a)中所提供的该甲基化DNA为可操作地连接于组成型启动子的甲基化报道基因且存在于具有内生的脊椎动物DNA甲基转移酶的细胞内；(b)在步骤(b)中所提供的该脊椎动物DNA甲基转移酶内生地存在于该细胞内，以作为该内生的脊椎动物DNA甲基转移酶；(c)在步骤(c)中所产生的该去甲基DNA产物是去甲基报道基因，其在该细胞内表达报道蛋白；(d)该分析步骤是通过选自于由下列所组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈哲鲲，陈俊彰，
申请(专利权)人：中央研究院，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71