本发明专利技术涉及一种检测DNA中5-甲基胞嘧啶的化学方法，该方法采用的两种化合物分别为取代的苯磺酰氯胺钠盐和取代的苯磺酰溴胺钠盐，具体检测步骤如下：先用取代的苯磺酰氯胺钠盐与带荧光标记的DNA中的胞嘧啶反应，再用取代的苯磺酰溴胺钠盐与带荧光标记的DNA中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶反应，然后用哌啶处理，通过比较DNA聚丙烯酰胺变性胶中两个反应的DNA带，可以清楚的看到5-甲基胞嘧啶的位置和个数。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种DNA中5-甲基胞嘧啶的化学检测方法。
技术介绍
表观遗传学被定义为研究基因表达水平(量变)信息的遗传。DNA甲基化是表观遗传学的主要形式。DNA甲基化与肿瘤有极大的关系。2003年，美国《science》杂志同期刊登的三篇文章已经肯定了 DNA的总体低甲基化导致的基因不稳定性对肿瘤的发生起着构成原因的作用。在老鼠模型中，目前已经证明从胚胎到成体发育过程中，利用DNA甲基化转移酶(DNMT)的突变导致染色体去甲基化，可以引起老鼠基因组不稳定和导致淋巴瘤。一般来说。肿瘤细胞DNA总体甲基化水平低于正常细胞，但某些特定基因(如肿瘤抑制基因)CpG岛却处 于高甲基化状态。DNA异常甲基化发生频率高的分子可作为临床监控病程和评估疗效的较好指标。同时，DNA异常甲基化发生频率高的分子也有望成为肿瘤早期诊断的肿瘤标志物。且在癌症防治上，可防止癌变早期基因组稳定性的发生，从而减少肿瘤易感性突变的可能，达到癌症的早期预防。DNA甲基化同时还与单亲遗传病、老化等也有很大关系。随着年龄的老化，基因组总体DNA甲基化水平逐渐降低。现有的甲基化化学检测方法主要有亚硫酸氢钠法、锇酸钾法及高碘酸钠法，但是亚硫酸氢钠法虽然检测时有较高的精确度，但是相对来说较为繁琐，且费时较长。锇酸钾法不能区分胸腺嘧啶和5-甲基胞嘧啶。而高碘酸钠法仍是会对少量的胸腺嘧啶的有氧化作用，因此高碘酸钠法的检测需进一步的完善以提高检测精度。相对于Maxam-GiIbert的化学测序法做C带用肼的方法,本专利技术采用了更安全、有效、无毒的试剂即对硝基苯磺酰氯胺钠盐和基本无毒的试剂即间硝基苯磺酰溴胺钠盐。检测DNA甲基化还有其他的方法，如将DNA降解为单核苷酸后采用化学分析仪器如液相色谱和质谱等进行分析，还有采用特异性甲基化限制性内切酶使DNA部分降解在通过southern印记法检测DNA中5-甲基胞嘧啶。然而这些方法检测5-甲基胞嘧啶的精确度有待于进一步的提高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供了一种方便、快速和精确度高的检测5-甲基胞嘧啶的化学方法。本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案是一种检测DNA中5-甲基胞嘧啶的化学方法，包括以下步骤I)取代的苯磺酰氯胺钠盐与带荧光标记的DNA样品中的胞嘧啶反应以乙腈为溶齐IJ，分别加入缓冲溶液、催化剂和取代的苯磺酰氯胺钠盐溶液，振荡离心，加入DNA样品后进行孵育；2)取代的苯磺酰溴胺钠盐与带荧光标记的DNA样品中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶反应以乙腈为溶剂，分别加入缓冲溶液、去离子水、取代的苯磺酰溴胺钠盐溶液，震荡离心,加入DNA样品后进行孵育；3)确定5-甲基胞嘧啶的位置和个数将步骤I)和2)孵育后的DNA样品除盐三次，再用哌啶处理，震荡离心后干燥，再将处理后的DNA样品上样，比较DNA聚丙烯酰胺变性胶中两个反应的DNA带，记录5-甲基胞嘧啶的位置和个数。取代的苯磺酰氯胺钠盐为对硝基苯磺酰氯胺钠盐I，取代的苯磺酰溴胺钠盐为间硝基苯磺酰溴胺钠盐II，I和II的结构式分别为权利要求1.一种检测DNA中5-甲基胞嘧啶的化学方法，其特征在于，包括以下步骤 1)取代的苯磺酰氯胺钠盐与带荧光标记的DNA样品中的胞嘧啶反应以乙腈为溶剂，分别加入缓冲溶液、催化剂和取代的苯磺酰氯胺钠盐溶液，振荡离心，加入DNA样品后进行孵育； 2)取代的苯磺酰溴胺钠盐与带荧光标记的DNA样品中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶反应以乙腈为溶剂，分别加入缓冲溶液、去离子水和取代的苯磺酰溴胺钠盐溶液，震荡离心，力口入DNA样品后进行孵育； 3)确定5-甲基胞嘧啶的位置和个数将步骤I)和2)孵育后的DNA样品除盐三次，再用哌啶处理，震荡离心后干燥，再将处理后的DNA样品上样，比较DNA聚丙烯酰胺变性胶中两个反应的DNA带，记录5-甲基胞嘧啶的位置和个数。2.根据权利要求I所述的一种检测DNA中5-甲基胞嘧啶的化学方法，其特征在于所述的取代的苯磺酰氯胺钠盐为对硝基苯磺酰氯胺钠盐I，取代的苯磺酰溴胺钠盐为间硝基苯磺酰溴胺钠盐II，I和II的结构式分别为3.根据权利要求I或2所述的一种检测DNA中5-甲基胞嘧啶的化学方法，其特征在于，所述的缓冲溶液为I μ IlOOmM的Tris-HCl缓冲溶液，pH为5。4.根据权利要求I或2所述的一种检测DNA中5-甲基胞嘧啶的化学方法，其特征在于，所述的催化剂为I μ IlOOmM的I2溶液。5.根据权利要求I或2所述的一种检测DNA中5-甲基胞嘧啶的化学方法，其特征在于，所述的取代的苯磺酰氯胺钠盐溶液和取代的苯磺酰溴胺钠盐溶液的体积均为I μ 1，浓度均为20mM。6.根据权利要求I或2所述的一种检测DNA中5-甲基胞嘧啶的化学方法，其特征在于，所述的去离子水的体积为I μ I。7.根据权利要求I或2所述的一种检测DNA中5-甲基胞嘧啶的化学方法，其特征在于，所述的DNA样品的体积为2 μ I,浓度为10 μ Μ。全文摘要本专利技术涉及一种检测DNA中5-甲基胞嘧啶的化学方法，该方法采用的两种化合物分别为取代的苯磺酰氯胺钠盐和取代的苯磺酰溴胺钠盐，具体检测步骤如下先用取代的苯磺酰氯胺钠盐与带荧光标记的DNA中的胞嘧啶反应，再用取代的苯磺酰溴胺钠盐与带荧光标记的DNA中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶反应，然后用哌啶处理，通过比较DNA聚丙烯酰胺变性胶中两个反应的DNA带，可以清楚的看到5-甲基胞嘧啶的位置和个数。文档编号C12Q1/68GK102912024SQ20121042748公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年10月30日专利技术者周翔, 王天露, 翁小成 申请人:武汉大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测DNA中5？甲基胞嘧啶的化学方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取代的苯磺酰氯胺钠盐与带荧光标记的DNA样品中的胞嘧啶反应：以乙腈为溶剂，分别加入缓冲溶液、催化剂和取代的苯磺酰氯胺钠盐溶液，振荡离心，加入DNA样品后进行孵育；2)取代的苯磺酰溴胺钠盐与带荧光标记的DNA样品中的胞嘧啶和5？甲基胞嘧啶反应：以乙腈为溶剂，分别加入缓冲溶液、去离子水和取代的苯磺酰溴胺钠盐溶液，震荡离心，加入DNA样品后进行孵育；3）确定5？甲基胞嘧啶的位置和个数：将步骤1）和2）孵育后的DNA样品除盐三次，再用哌啶处理，震荡离心后干燥，再将处理后的DNA样品上样，比较DNA聚丙烯酰胺变性胶中两个反应的DNA带，记录5？甲基胞嘧啶的位置和个数。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周翔，王天露，翁小成，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：
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